Lacases marinhas: expressão heteróloga, estrutura e aplicação

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Otero, Igor Vinicius Ramos [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Biotecnologia microbiana; Enzimas microbianas; Biodegradação; Microbial biotechnology; Microbial enzymes; Biodegradation
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/239045

Lacases de origem marinha podem oxidar diferentes compostos fenólicos e aminícos, além de apresentar boa termoestabilidade e tolerância a sais. A expressão heteróloga de lacases pode ser uma estratégia vantajosa para obter essas enzimas em larga escala, facilitando os processos de purificação, minimizando custos e otimizando o tempo de produção. Diferentes variáveis moleculares e metabólicas podem interferir na expressão heteróloga de lacases. Portanto, é necessário utilizar sistemas de expressão que possibilitem a análise dessas variáveis em menos tempo e com mais eficiência. No presente estudo, a lacase codificada pelo gene Pnh_Lac1 (Lac1) do fungo marinho Peniophora sp. CBMAI 1063 foi selecionada para expressão em Pichia pastoris utilizando o sistema Pichia Toolkit. Promotores constitutivos (n=5) e indutivos (n=3) foram avaliados em associação com diferentes peptídeos sinal (n=21) quanto à sua eficiência na produção da Lac1. A influência da his-tag na produção da Lac1 também foi avaliada. Após a seleção da variante com melhor construção molecular, diferentes condições de cultivo foram testadas, visando selecionar as melhores condições para expressão da enzima heteróloga. Posteriormente, a Lac1 foi purificada e caracterizada. Os promotores pGAP e pAOX1 apresentaram o melhor desempenho nas bibliotecas constitutivas e indutivas, respectivamente. A associação com o sinal peptídico aamilase- aMFD foi mais eficiente para ambos os promotores. A expressão constitutiva da Lac1 teve uma produção 1,37 vezes maior que a expressão induzida por pAOX1. A variante 117 foi selecionada para otimização das condições de cultivo. Temperatura (18 ˚C) e pH (6) foram as variáveis que mais influenciaram a expressão heteróloga de Lac1. A lacase heteróloga apresentou tamanho aproximado de 72 kDa com alta afinidade para siringaldazina e ABTS, atividade ótima a 60 ˚C e pH 3 com boa termoestabilidade (T501h = 56 ˚C). Lac1 foi inibida por seus inibidores convencionais, mas apresentou grande tolerância a íons metálicos. Apesar de sua origem marinha, Lac1 não apresentou alta tolerância ao NaCl. Sob baixa concentração enzimática, condições não ótimas e na presença de mediadores, a Lac1 foi capaz de descolorir corantes sintéticos de diferentes classes, com excelente desempenho na descoloração do corante índigo carmim (93% após 2h de incubação). Experimentos em Erlenmeyer com o corante preto reativo 5 demonstraram a habilidade da enzima em descolorir 62% do corante após 36h de incubação, na presença do mediador siringaldeído. Análises de metabólitos em GC-MS revelaram a habilidade do LMS na degradação do corante tóxico em moléculas menores e menos recalcitrantes. Contudo, análises de toxicidade revelaram que a degradação do corante preto reativo 5 pela Lac1 na presença de siringaldeído, pode resultar em compostos com toxicidade ainda elevada. Até o momento, este é o primeiro caso da utilização de um Toolkit para a expressão heteróloga de uma lacase em P. pastoris. Os resultados obtidos neste estudo contribuem para o desenvolvimento da biotecnologia marinha mostrando o potencial da Lac1 para aplicação biotecnológica em processos de descoloração/degradação de corantes sintéticos em diferentes temperaturas, bem como na presença de íons metálicos e solventes.