Avaliação do efeito de vesículas extracelulares de carcinoma hepatocelular sob parâmetros de ativação da linhagem LX-2 de células estreladas hepáticas

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Martins, Renata Krüger
• Orientador(a): Guma, Fátima Theresinha Costa Rodrigues
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Vesículas extracelulares; Carcinoma hepatocelular; Células estreladas do fígado; Linhagem celular tumoral; Soroalbumina bovina
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/291146

As células estreladas hepáticas (HSCs) são o principal tipo celular responsável pela secreção de matriz extracelular (ME) no fígado. Em situações de dano hepático crônico ocorre o acúmulo de ME, causando fibrose hepática que pode evoluir para cirrose ou carcinoma hepatocelular (CHC). A transdiferenciação das HSCs de um fenótipo quiescente, capaz de estocar gotas lipídicas, para o fenótipo ativado secretor de proteínas de ME é o evento chave no desenvolvimento da fibrose. A LX-2 é uma linhagem de HSCs usada em modelos in vitro de fibrose hepática, que pode ter seu fenótipo modulado pela concentração de soro fetal bovino (SFB) no meio de cultivo, com baixas concentrações tornando-as quiescentes, e altas concentrações levando à ativação. O CHC é o tipo de câncer de fígado mais letal, cujo desenvolvimento ocorre em quadros de fibrose avançada. O microambiente tumoral tem uma participação importante no desenvolvimento do CHC, com a ativação de HSCs em fibroblastos associados ao câncer (CAFs) impactando diretamente na agressividade da doença e resposta à quimioterápicos. Vesículas extracelulares (VEs) atuam na comunicação celular pela transferência de moléculas variadas, com impacto no estado fisiológico e patológico. O objetivo deste trabalho é testar o modelo de ativação das LX-2 pela concentração de SFB no meio de cultivo, e então, avaliar o efeito de vesículas extracelulares provenientes da linhagem HepG2, em parâmetros de ativação da linhagem LX-2. A linhagem LX-2 foi exposta ao meio de cultivo DMEM high glucose suplementado com 2% ou 10% SFB, para comparação dos principais marcadores do fenótipo ativado. A biomassa celular foi avaliada pelo ensaio de Sulforrodamina B, a presença de gotas lipídicas foi avaliada pelo ensaio de AdipoRed, a expressão proteica de colágeno e da proteína Ki-67, marcadora da proliferação celular, foram feitos por citometria de fluxo. Foi avaliada também, a expressão gênica de ColIa1, TGFβ e ACTA2 por RT-PCR, e quantificação da migração celular pelo ensaio de Wound healing. As vesículas extracelulares foram isoladas da linhagem HepG2 por ultracentrifugação, e tiveram tamanho e número de partículas identificados por NTA, e morfologia visualizada por MET. As células LX-2 foram expostas às vesículas de HepG2 (HepG2-VEs) à 20 μg/mL e tiveram a viabilidade avaliada pelo ensaio de MTT e morte celular avaliada por Anexina/PI e os demais parâmetros de ativação analisados em citometria de fluxo. A comparação do cultivo de LX-2 com 2% e 10% demonstrou um aumento na biomassa e no conteúdo de gotas lipídicas em 10%, e da expressão proteica de COLIa1, junto de uma tendência ao aumento da expressão gênica de ACTA2. O meio 10% SFB também provocou diminuição na proliferação, mas não afetou a expressão gênica de TGFβ e ColIa1, nem a migração celular. A exposição à HepG2-VEs provocou a diminuição na viabilidade de LX-2 e no conteúdo de gotas lipídicas, aumento na proliferação celular, e na expressão de colágeno. Não foi observada diferença significativamente estatística nos parâmetros de morte celular. Não podemos afirmar que as células mantidas em 2% de SFB estão quiescentes em contraponto às mantidas em 10% SFB ativadas. A partir das tendências observadas no aumento na expressão proteica de colágeno e na expressão gênica de ACTA2, é possível que ambos os grupos estejam ativados, mas com subpopulações em um estado mais ativado que outras. Já, a exposição das LX-2 à HepG2-VEs foi capaz de induzir a ativação, observada pela redução de gotas lipídicas, e aumento na expressão proteica de colágeno e da proliferação celular. É possível que, a diminuição na atividade mitocondrial seja decorrente de um reajuste metabólico, levando as células à um perfil mais glicolítico. Tais resultados demonstram a capacidade das VEs de CHC modularem as HSCs recipientes ao fenótipo de miofibroblastos.