Uso de Bacteriófagos Recombinantes para Detecção Rápida de Escherichia coli O157:H7 e Salmonella spp. em Alimentos

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Aquino, Nathanyelle Soraya Martins
• Orientador(a): Tondo, Eduardo Cesar
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Segurança alimentar; Patógenos alimentares; Bovinocultura; Ovinocultura
• Palavras-chave em Inglês: Detection methods; food safety; Foodborne pathogens; Cattle; Poultry
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/238527

Escherichia coli O157:H7 e Salmonella spp. são dois dos mais importantes microrganismos causadores de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) no mundo. Nos últimos anos, o Brasil vem liderando as exportações mundiais de carne bovina e avícola, alimentos que podem ser veículos destes patógenos. Antes da exportação, esses alimentos devem ser testados para garantir a ausência dos microrganismos citados e, quanto menor for o tempo de análise, maior é a vantagem competitiva das empresas exportadoras. Neste estudo, foram avaliados dois novos ensaios para detecção de E. coli O157:H7 e Salmonella spp. em alimentos. PhageDx E. coli O157:H7 Assay e PhageDx Salmonella Assay são métodos baseados no uso de bacteriófagos recombinantes, capazes de detectar E. coli O157:H7 e Salmonella spp. em tempos menores que outros métodos. Até o presente estudo, esses kits não haviam sido testados para a detecção de cepas brasileiras. Logo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a especificidade, limite de detecção e sensibilidade dos kits PhageDx E. coli O157:H7 Assay e PhageDx Salmonella Assay em detectar E. coli O157:H7 e Salmonella spp. isoladas no Brasil. Primeiramente, realizou-se o teste de inclusividade com 55 isolados de Salmonella spp. e 14 isolados de E. coli O157:H7. Em seguida, foi determinado o limite de detecção in vitro dos kits. Para isto, três concentrações diferentes (1, 10 e 100 UFC/poço de microplaca) dos microrganismos avaliados foram submetidas a 2 h de infecção fágica a 37 ºC. A terceira etapa deste trabalho foi determinar o limite de detecção dos kits em alimentos. Para o kit PhageDx Salmonella Assay, inoculou-se 1 mL do coquetel de Salmonella spp. (concentrações de 1, 10 e 100 UFC) em 25 g de alface, peito de frango, salsicha de frango, patê de frango e nuggets. Em seguida, as amostras foram acrescidas de 75 mL de água peptonada tamponada e enriquecidas a 41 º C por 7 h antes de serem submetidas à 2 h de infecção fágica a 37 ºC. Utilizando a mesma metodologia mencionada acima, testou-se o kit PhageDx E. coli O157:H7 Assay. Neste teste, 1 mL do coquetel de E. coli O157:H7 nas mesmas concentrações, foi adicionado a 25 g de carne moída e alface, e a 25 mL de leite pasteurizado e água mineral. Posteriormente, caldo triptona de soja foi adicionado às amostras e a mistura foi incubada por 5 h a 41 º C antes de serem submetidas à 2 h de infecção fágica a 37 ºC. Além disso, o PhageDx E. coli O157:H7 Assay teve seu desempenho comparado a um kit de PCR em tempo real para pesquisa de E. coli O157:H7 e Escherichia coli enterohemorrágicas, respectivamente, em carcaças bovinas. Com relação aos resultados obtidos, verificou-se que todos os isolados testados foram identificados pelo seu respectivo kit e o limite de detecção in vitro foi de 100 UFC/poço, em apenas 2 h, ou seja, sem enriquecimento das amostras. Os kits também foram capazes de detectar 1 UFC dos patógenos em 25 g (ou 25 mL) de alimentos, após 5 e 7 horas de enriquecimento, para E. coli O157:H7 e Salmonella spp., respectivamente. Apenas a detecção de Salmonella spp. em alface apresentou um limite de detecção ligeiramente superior aos demais alimentos, isso é, 10 UFC/25 g. O kit PhageDx E. coli O157:H7 Assay não detectou a presença E. coli O157:H7 em nenhuma das 100 carcaças bovinas avaliadas. Em concordância com este resultado, o kit de PCR em tempo real não detectou a presença de E. coli enterohemorrágica. Os ensaios avaliados demonstraram ser satisfatórios para detecção de E. coli O157:H7 e Salmonella spp. isoladas no Brasil, apresentando sensibilidade, especificidade e rapidez ao avaliarem diferentes matrizes alimentares. A detecção de uma única célula de Salmonella spp. em 25 g de amostra, após aproximadamente 9 h de ensaio, representa uma redução significativa de tempo em comparação aos métodos tradicionais e rápidos disponíveis atualmente no mercado. O mesmo foi observado para o kit de Escherichia coli O157:H7, cujo tempo de análise foi de cerca de 7 h. Além disso, os kits demonstraram ser fáceis de executar, tornando-os ferramentas promissoras para a detecção de E. coli O157:H7 e Salmonella spp. em diferentes alimentos.