Identificação e caracterização molecular de mutações e polimorfismos no gene da fenilalanina hidroxilase em fenilcetonúricos do sul do Brasil

• Ano de defesa: 2000
• Autor(a) principal: Silva, Luiz Carlos Santana da
• Orientador(a): Giugliani, Roberto
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Fenilcetonúrias; Fenilalanina hidroxilase; Mutação; Polimorfismo genético; Brasil, Sul
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/275871

A Hiperfenilalaninemia (HPA) decorrente da deficiência da fenilalanina hidroxilase (PAH) é um distúrbio metabólico herdado de modo autossômico recessivo. O gene da PAH localiza-se na região q22-q24.1 do cromossomo 12 e abrange 90 kb de DNA dividido em 13 exons, os quais codificam um mRNA de aproximadamente 2,4 kb. Até o momento, 412 diferentes alterações foram identificadas no locus da PAH. A grande heterogeneidade molecular observada neste gene pode estar ligada à variabilidade do fenótipo nos pacientes com HPA por deficiência de PAH. O presente estudo teve como objetivos principais determinar a freqüência das mutações e estabelecer uma correlação entre os dados bioquímicos e clínicos com as alterações moleculares encontradas nos pacientes com HPA por deficiência de PAH no Sul do Brasil. A amostra foi composta por 30 pacientes não relacionados que se encontram em tratamento no Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Este estudo foi aprovado pela Comissão Científica e pela Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde do HCPA, estando adequado ética e metodologicamente, de acordo com as Normas de Pesquisa em Saúde (resolução 01 /88 do Conselho Nacional de Saúde). O protocolo aplicado compreendeu a extração de DNA e posterior amplificação por PCR de 13 fragmentos do gene da PAH. Os produtos de PCR foram analisados pela técnica de polimorfismos conformacionais de cadeia simples (SSCP). As amostras que apresentaram padrões de mobilidade eletroforética alterados foram submetidas à análise por digestão com endonucleases de restrição específicas e/ou seqüenciamento. Os pacientes foram classificados em subgrupos (PKU leve, PKU moderada e PKU clássica), de acordo com a tolerância à Phe quando em dieta controlada. A técnica de SSCP permitiu a identificação de 25 pacientes (83,3%) com alterações nos fragmentos analisados do gene da PAH. Neste estudo, foram encontradas 24 alterações diferentes, sendo identificados 26 genótipos distintos associados à HPA por deficiência de PAH. A análise com endonucleases de restrição possibilitou a detecção de 8 mutações (I65T, R252W, R261Q, R261X, IVS10nt-11g>a, V388M, R408W e IVS12nt1g>a). O seqüenciamento direto permitiu a detecção de 16 alterações, sendo 10 mutações associadas à doença (L15/S16fsdelCT, IVS2nt5g>c, F55fsdelT, IVS2nt-13t>g, N133/Q134fsdelATCA, R158Q, R270K, P281L, IVS7nt1g>a e R408Q), 4 polimorfismos (IVS2nt19t>c, V245V, Y414Y e IVS12nt-35c>t) e duas alterações novas no gene da PAH: 1378g>t e IVS12nt-15t>c. As técnicas empregadas neste estudo permitiram a identificação de pelo menos um alelo mutante em todos os pacientes analisados e o genótipo foi determinado em 23 dos 30 pacientes. A freqüência de mutações identificadas neste estudo foi de 87,3% (48/55) e as mais freqüentes foram a I65T (18,2%), a R261X (9,1%), a R408W (9,1%), a IVS2nt5g>c (7,3%), a R261Q (7,3%) e a V388M (7,3%). As mutações raras apresentaram freqüências variando entre 1,8% e 5,5%. A presença de polimorfismos foi observada em 46,6% dos pacientes com HPA por deficiência de PAH, sendo os polimorfismos IVS2nt19t>c, V245V e IVS12nt-35c>t os mais freqüentes. O espectro de mutações encontrado em nossos pacientes é diferente do observado em pacientes de outros países da América Latina, confirmando a heterogeneidade molecular desta doença. Não foi estabelecido uma correlação entre os valores de atividade residual prevista (ARP) para a fenilalanina hidroxilase com os parâmetros clínicos e bioquímicos, tanto em pacientes com diagnóstico precoce como tardio. Mas foi, no entanto, observada uma correlação entre os valores de ARP e os níveis de Tyr durante o tratamento em pacientes com diagnóstico precoce, indicando que os mesmos podem exercer um papel importante no controle da dieta e na determinação do fenótipo dos pacientes. A análise de regressão linear simples mostrou uma forte relação entre a tolerância à Phe da dieta e os níveis de Phe pré e durante o tratamento, permitindo a classificação fenotípica dos pacientes com diagnóstico precoce. Esta análise mostrou também uma associação significativa entre a tolerância à Phe da dieta e os níveis de Phe durante o tratamento, permitindo também a determinação do fenótipo na maioria dos pacientes com diagnóstico tardio. Estes resultados ressaltam a importância do diagnóstico precoce e de um adequado controle dietético em pacientes com HPA por deficiência de PAH. Os níveis de Phe e Tyr não foram capazes de determinar a gravidade de mutações em heterozigotos para HPA por deficiência de PAH, tanto na situação de jejum como após a sobrecarga de aspartame. Nas duas situações testadas, as relações Phe/Tyr e Phe2/Tyr foram consideradas os melhores parâmetros para discriminar indivíduos heterozigotos e controles. Este estudo se constitui numa contribuição original ao conhecimento das bases moleculares da HPA por deficiência de PAH no Sul do Brasil, trazendo informações relevantes para o melhor entendimento da relação genótipo-fenótipo neste distúrbio.