Pseudomonas aeruginosa isoladas de pacientes portadores e não portadores de fibrose cística : avaliação da formação de biofilme, quorum-sensing, auxotrofia e resistência antimicrobiana

• Ano de defesa: 2010
• Autor(a) principal: Perez, Leandro Reus Rodrigues
• Orientador(a): Barth, Afonso Luis
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Pseudomonas aeruginosa; Fibrose cística; Biofilmes; Resistência bacteriana
• Palavras-chave em Inglês: Cystic fibrosis; Biofilm; Antimicrobial resistence
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/268198

Pseudomonas aeruginosa é um importante patógeno no âmbito hospitalar. O presente estudo teve o objetivo de caracterizar isolados clínicos de P. aeruginosa de pacientes portadores e não portadores de fibrose cística com relação a sua habilidade para produção de biofilmes, requerimento nutricional, expressão fenotípica da produção de moléculas autoindutoras do sistema quorum-sensing (QS), detecção de genes envolvidos no controle do sistema QS e detecção de genes carbapenemases, sobretudo metalo-β-lactamases (MBLs). Preliminarmente, 74 P. aeruginosa foram avaliadas com relação à capacidade de produção de biofilme. Nesta análise, 68% mostraram serem produtores de biofilme. Subseqüentemente, a produção de biofilme foi avaliada em 124 isolados clínicos utilizando-se dois diferentes meios: Tryptic Soy Broth (TSB) e um pool de escarros provenientes de pacientes com fibrose cística. A capacidade de produção de biofilme, nos dois meios, não apresentou diferença estatiscamente significativa, independentemente da origem dos isolados (fibrose cística ou não). Entretanto, uma maior produção de biofilme foi observada quando os isolados foram submetidos a este crescimento no meio TSB (p=0,0198). Os isolados clínicos produtores de biofilme que foram obtidos de pacientes sem fibrose cística mostraram ser mais resistentes aos carbapenêmicos - imipenem e meropenem - do que aqueles isolados de pacientes com fibrose cística. A auxotrofia foi avaliada entre 349 isolados de P. aeruginosa e detectada em 14 (4%) amostras, sendo apenas uma oriunda de paciente não-fibrocístico. O aminoácido mais requerido foi metionina (Met-) (8/14). As amostras auxotróficas foram avaliadas quanto a capacidade de produzir biofilme e apenas um isolado (Met-) foi não produtor de biofilme. Este foi o primeiro relato de auxotrofia entre P. aeruginosa isoladas de amostras clínicas no Brasil. Muitos mecanismos, principalmente aqueles associados à virulência de P. aeruginosa, são controlados pelo sistema QS através de moléculas conhecidas como autoindutoras (AHLs). Neste estudo não encontramos diferença significativa entre isolados de fibrose cística e não fibrose cística, referente à detecção fenotípica de AHLs. Entretanto, a produção de moléculas autoindutoras parece estar associada àqueles com maior capacidade de produção de biofilme, mostrando ser uma característica relacionada à densidade microbiana. Quanto aos genes de resistência aos carbapenêmicos, 91 isolados foram avaliados para presença dos genes SPM-1, IMP-1 e VIM-2 codificadores de MBLs, pela reação em cadeia da polimerase. Entre estes, 21 (23.1%) isolados foram positivos para genes de MBLs. A presença do gene SPM-1 foi maior entre os isolados não-fibrocísticos. Por outro lado, nós encotramos uma elevada prevalência do gene IMP-1 entre isolados de P. aeruginosa de pacientes com fibrose cística. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro relato no Brasil, de P. aeruginosa IMP-1 em pacientes com fibrose cística. Adicionalmente, todos isolados positivos para a presença de MBL mostraram capacidade, sobretudo moderada e forte, para produção de biofilme. Testes fenotípicos têm sido utilizados para predizer a presença de MBL em P. aeruginosa. Entretanto, nenhum tem sido preconizado pelos comitês internacionais. Nós avaliamos 14 diferentes combinações de testes fenotípicos de 1) sinergismo utilizando ceftazidima (CAZ) e imipenem (IMP) como substratos e ácido 2-mercaptopropiônico (2MPA) e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como agentes inibidores da enzima em distâncias de 1, 2 e 2,5 cm entre os discos e de 2) disco-combinado de IMP e/ou CAZ com EDTA para predizer a presença de MBL. Nesta etapa de estudo, foram avaliadas amostras provenientes de um surto hospitalar (n=7) e amostras de pacientes com fibrose cística (n=14). Nós encontramos uma tendência de melhor resultado para o teste de disco combinado IMP-EDTA, embora um resultado falso-positivo tenha ocorrido. Finalmente, foi realizada uma análise para avaliação da presença dos genes que compõem os principais sistemas de QS e sua correlação com a produção de biofilme e moléculas AHLs. Um total de 91 isolados (85 produtores de biofilme e 6 não produtores de biofilme) foi avaliado. Entre os não produtores de biofilme, quatro isolados foram negativos para genes lasI, lasR, rh/I e rh/R, e dois foram negativos para lasI e lasR. Este resultado mostra a importância do sistema las no controle da virulência em P. aeruginosa, sobretudo no processo de formação de biofilme.