Análise da influência do microambiente tumoral ácido sobre a resposta imune no carcinoma espinocelular oral

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Souza, Rita de Kássia
• Orientador(a): Visioli, Fernanda
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Câncer bucal; Imunidade; Linfócitos T; Interleucina-2; Fator de necrose tumoral alfa
• Palavras-chave em Inglês: Oral cancer; Tumor acidity; Immune response; T cells; IL-2; TNF-alpha; Interferon-gamma; PD-L1; PD-1
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/280563

Uma característica marcante do microambiente dos tumores sólidos é a acidificação do pH extracelular. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos do microambiente tumoral (MT) ácido sobre os mecanismos de evasão à resposta imune mediada por células T contra o carcinoma espinocelular bucal (CEC). Primeiramente foi realizado o cultivo celular das linhagens de CEC de boca (SCC25) e linfócitos T de leucemia aguda (Jurkat) de forma individual, separadas em diferentes grupos, meio neutro (pH 7.4) e ácido modificado com ácido clorídrico HCl (pH 6.8), e mantidas em estufa a 37°C e 5% de CO2, além de serem monitoradas diariamente em microscópio invertido de fase (Biostar, American Optical). Em um segundo momento foi realizado o co-cultivo dessas duas linhagens em diferentes condições experimentais e posteriormente foram avaliados desfechos em tempos experimentais distintos, como os efeitos do meio de cultura acidificado sobre os índices de morte celular de linfócitos T e das células de CEC através de ensaios de Duplicação Cumulativa da População (CPD), Imunofluorescência, Western Blot, secreção das citocinas inflamatórias interleucina-2 (IL-2) e interferon-gama (IFNγ) utilizando o kit Enzyme Linked Immunonosorbent Assay (ELISA), bem como a expressão das moléculas de reconhecimento celular PD-1 e PD-L1 por meio de citometria de fluxo, além da formação de esferas através de Cultura 3D em co-cultivo com análise morfométrica e de densidade óptica (OD). A análise estatística foi realizada através dos testes ANOVA ou ANOVA two-way, seguidos do teste de Bonferroni, post-hoc de Tukey ou teste t de Student, conforme apropriados, utilizando o programa GraphPad Prism 5.0 (La Jolla, CA). Após exposição ao meio ácido, a análise de CPD indicou diminuição da capacidade proliferativa das células T (p<0.001) e aumento nas células cancerígenas (p<0.01), além de diminuir a viabilidade das células imunes. Observou-se ainda que a acidez do MT promove alterações fenotípicas e morfológicas nas células SCC25, além de aumentar a expressão do marcador de transição epitélio-mesênquima (TEM) Vimentina. O pH ácido contribui para maior resistência das células malignas à morte induzida pelas células T (p<0.001). Não detectamos diferença na proporção de células SCC25 positivas para PD-L1 quando expostas ao meio ácido. Em contrapartida, vemos uma diminuição discreta e não significativa de PD-1 nas células T cultivadas em pH 6.8. Esferas formadas pelas células tumorais SCC25 isoladamente em seu meio ótimo para crescimento DMEM F12 demonstraram inicialmente diminuição da sua área e perímetro, além de semelhança no tamanho e agregação durante todo o período do experimento (p<0.001). Em contrapartida os esferóides mantidos em ambiente ácido apresentaram uma diminuição de área e perímetro nas primeiras 24h, seguidos por um período de estabilidade (p<0.001). Com relação a densidade óptica, as esferas nessa condição apresentaram uma OD média inicial em 12 horas significativamente mais alta (p<0.001) comparada com os grupos citados anteriormente, a qual diminuiu a partir desse período até o final do tempo experimental e que finalizou com um valor OD menor do que as esferas em pH 7.4 (p<0.001). O cocultivo de células tumorais SCC25 com células T resultou em esferas expandidas independentemente do pH, com crescimento ligeiramente maior em pH 6.8 (p<0.05). Os esferóides em meio ácido inicialmente apresentaram menor OD (p<0.001), mas essa diferença diminuiu após 72 horas. No entanto, não foi possível o processamento histológico dessas esferas devido à tendência de desagregação. No sistema de co-cultivo houve maior secreção de IFNγ em meio ácido (p>0.05). Não foi detectado IFNγ em SCC25 ou células T isoladamente em pH 7.4 ou 6.8. Os níveis de IL-2 aumentaram nas células SCC25 em pH 6.8, mas sem significância estatística; não foi detectada IL-2 nas células T em pH neutro ou ácido. Os achados deste estudo destacam a influência exercida pela acidez do MT na evasão das células cancerígenas à resposta imune e na progressão do CEC bucal, diminuindo a viabilidade e função das células T.