Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2018
Autor(a) principal: Custodio, Débora Fernandes
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Acute lymphoid leukemia
Biofármaco
Biopharmaceutical
epPCR
Evolução sintética de proteínas
Leucemia linfoide aguda
Synthetic protein evolution
Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-11062018-104646/
Resumo: A L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia. Essa enzima depleta os aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln), transformando-os em aspartato (Asp) ou glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a L-ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos antiasparaginase, uma causa importante de resistência ao medicamento. Uma L-ASNase ideal seria aquela com alta atividade e estabilidade e baixo potencial imunogênico, porém, as L-ASNases utilizadas na terapêutica não reúnem essas características simultaneamente. Por essa razão, o presente trabalho utilizou técnicas de mutagênese randômica, a fim de criar uma nova proteoforma de L-ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade. Além disso, foram estudadas condições de cultivo em agitador metabólico, visando à otimização de condições de produção. Foi criada uma biblioteca com 1.056 clones, e desses, 19 foram selecionados por apresentarem atividade superior ou igual à enzima selvagem quando dosada em extrato bruto. Dentre eles, dois mutantes se destacaram por apresentarem a atividade específica glutaminásica diferente da enzima selvagem. Análises in silico indicam que o mutante 9-6D apresentou diminuição de desordem estrutural e epítopos imunogênicos. O mutante 9-5F demonstrou uma diminuição da porcentagem da atividade glutaminásica quando comparada a enzima selvagem. O estudo de produção do mutante 9-5F indicou que a temperatura de indução, seguida da concentração do indutor, são os parâmetros mais relevantes para a otimização da produção de L-ASNase de E. chrysanthemi mutante.
id USP_0652ae01178c939b62b48ee083fc75b3
oai_identifier_str oai:teses.usp.br:tde-11062018-104646
network_acronym_str USP
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
repository_id_str
spelling Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produçãoCharacterization of Erwinia chrysanthemi L-Asparaginase improved by synthetic protein evolution and optimization of production conditionsAcute lymphoid leukemiaBiofármacoBiopharmaceuticalepPCRepPCREvolução sintética de proteínasLeucemia linfoide agudaSynthetic protein evolutionA L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia. Essa enzima depleta os aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln), transformando-os em aspartato (Asp) ou glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a L-ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos antiasparaginase, uma causa importante de resistência ao medicamento. Uma L-ASNase ideal seria aquela com alta atividade e estabilidade e baixo potencial imunogênico, porém, as L-ASNases utilizadas na terapêutica não reúnem essas características simultaneamente. Por essa razão, o presente trabalho utilizou técnicas de mutagênese randômica, a fim de criar uma nova proteoforma de L-ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade. Além disso, foram estudadas condições de cultivo em agitador metabólico, visando à otimização de condições de produção. Foi criada uma biblioteca com 1.056 clones, e desses, 19 foram selecionados por apresentarem atividade superior ou igual à enzima selvagem quando dosada em extrato bruto. Dentre eles, dois mutantes se destacaram por apresentarem a atividade específica glutaminásica diferente da enzima selvagem. Análises in silico indicam que o mutante 9-6D apresentou diminuição de desordem estrutural e epítopos imunogênicos. O mutante 9-5F demonstrou uma diminuição da porcentagem da atividade glutaminásica quando comparada a enzima selvagem. O estudo de produção do mutante 9-5F indicou que a temperatura de indução, seguida da concentração do indutor, são os parâmetros mais relevantes para a otimização da produção de L-ASNase de E. chrysanthemi mutante.L-Asparaginase (L-ASNase) is a bacterial tetrameric enzyme used in chemotherapy sessions that deplete asparagine (Asn) and glutamine (Gln), transforming them into Aspartate (Asp) or glutamate (Glu), respectively, and ammonia. However, L-ASNase can induce immune response leading to the production of anti-asparaginase antibody, an important cause of drug resistance. Ideally, L-ASNase would be one with high activity, high stability and low immunogenic potential, but the L-ASNases commercially available today do not present these characteristics simultaneously. For this reason, this study used techniques of random and site-directed mutagenesis in order to create a new proteoform of E. chrysanthemi L-ASNase with improved activity and stability. In addition, culture conditions were studied in a metabolic shaker, aiming at the optimization of production conditions. A library with 1,056 clones was created, and of these clones, 19 were selected because they had activity superior or equal to the wild-type enzyme in crude protein extract. Among them, 2 mutants stood out for having different glutaminase specific activity in relation to wild-type enzyme. The 9-6D mutant also showed decreased structural disorder and immunogenic epitopes. The 9-5F mutant demonstrated a decrease in percentage of glutaminase activity when compared to the wild-type enzyme. The production study of 9-5F mutant indicated that the induction temperature followed by the inductor concentration are the most relevant parameters for the production optimization of E. chrysanthemi mutant L-ASNase.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPMonteiro, GiselePessoa Junior, AdalbertoCustodio, Débora Fernandes2018-05-07info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttp://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-11062018-104646/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2018-09-20T19:49:24Zoai:teses.usp.br:tde-11062018-104646Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212018-09-20T19:49:24Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false
dc.title.none.fl_str_mv Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção
Characterization of Erwinia chrysanthemi L-Asparaginase improved by synthetic protein evolution and optimization of production conditions
title Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção
spellingShingle Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção
Custodio, Débora Fernandes
Acute lymphoid leukemia
Biofármaco
Biopharmaceutical
epPCR
epPCR
Evolução sintética de proteínas
Leucemia linfoide aguda
Synthetic protein evolution
title_short Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção
title_full Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção
title_fullStr Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção
title_full_unstemmed Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção
title_sort Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção
author Custodio, Débora Fernandes
author_facet Custodio, Débora Fernandes
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Monteiro, Gisele
Pessoa Junior, Adalberto
dc.contributor.author.fl_str_mv Custodio, Débora Fernandes
dc.subject.por.fl_str_mv Acute lymphoid leukemia
Biofármaco
Biopharmaceutical
epPCR
epPCR
Evolução sintética de proteínas
Leucemia linfoide aguda
Synthetic protein evolution
topic Acute lymphoid leukemia
Biofármaco
Biopharmaceutical
epPCR
epPCR
Evolução sintética de proteínas
Leucemia linfoide aguda
Synthetic protein evolution
description A L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia. Essa enzima depleta os aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln), transformando-os em aspartato (Asp) ou glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a L-ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos antiasparaginase, uma causa importante de resistência ao medicamento. Uma L-ASNase ideal seria aquela com alta atividade e estabilidade e baixo potencial imunogênico, porém, as L-ASNases utilizadas na terapêutica não reúnem essas características simultaneamente. Por essa razão, o presente trabalho utilizou técnicas de mutagênese randômica, a fim de criar uma nova proteoforma de L-ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade. Além disso, foram estudadas condições de cultivo em agitador metabólico, visando à otimização de condições de produção. Foi criada uma biblioteca com 1.056 clones, e desses, 19 foram selecionados por apresentarem atividade superior ou igual à enzima selvagem quando dosada em extrato bruto. Dentre eles, dois mutantes se destacaram por apresentarem a atividade específica glutaminásica diferente da enzima selvagem. Análises in silico indicam que o mutante 9-6D apresentou diminuição de desordem estrutural e epítopos imunogênicos. O mutante 9-5F demonstrou uma diminuição da porcentagem da atividade glutaminásica quando comparada a enzima selvagem. O estudo de produção do mutante 9-5F indicou que a temperatura de indução, seguida da concentração do indutor, são os parâmetros mais relevantes para a otimização da produção de L-ASNase de E. chrysanthemi mutante.
publishDate 2018
dc.date.none.fl_str_mv 2018-05-07
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-11062018-104646/
url http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-11062018-104646/
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv
dc.rights.driver.fl_str_mv Liberar o conteúdo para acesso público.
info:eu-repo/semantics/openAccess
rights_invalid_str_mv Liberar o conteúdo para acesso público.
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.coverage.none.fl_str_mv
dc.publisher.none.fl_str_mv Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
publisher.none.fl_str_mv Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
dc.source.none.fl_str_mv
reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
instname:Universidade de São Paulo (USP)
instacron:USP
instname_str Universidade de São Paulo (USP)
instacron_str USP
institution USP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)
repository.mail.fl_str_mv virginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.br
_version_ 1815258031827451904

Registros relacionados