Avaliação proteômica do processo de ubiquitinação durante a transição epitélio-mesênquimal em células MCF7: implicações na regulação de histonas H2A1

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Vargas, Alessandra Pinto
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Análise proteômica; Breast cancer; Câncer de mama; Deubiquitinação; Deubiquitination; EMT; Epithelial-mesenchymal transition; Histonas; Histones; MCF7; Modificações pós-traducionais; P5091; Post-translational modifications; Proteomic analysis; PRT4165; Transição epitélio-mesenquimal; Ubiquitinação; Ubiquitination
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-24062025-100025/

Entre as principais marcas do câncer estão a capacidade de invasão tecidual e metástase. No início do processo metastático, as células passam pela transição epitélio-mesenquimal (EMT), levando as células epiteliais a desenvolverem características de células mesenquimais, adquirindo motilidade à medida que perdem a adesão célula-célula e à membrana basal. Em todas as células, a modulação de processos e alterações disparada por cascatas de sinalização dependem de mecanismos finamente controlados por modificações pós-traducionais (PTMs). Alguns estudos indicam que a modificação pós-traducional de proteínas do tipo ubiquitinação está intimamente relacionada a EMT, favorecendo ou impedindo a progressão tumoral através de ubiquitinação/deubiquitinação proteínas oncogenes ou agentes supressores tumorais. Procurando delinear o papel que a ubiquitinação/deubiquitinação pode desempenhar na metástase, induzimos EMT in vitro utilizando EGF em células de adenocarcinoma de mama (MCF-7). Após a validação funcional e morfológica do modelo de EMT, por ensaios de Western blot, migração celular e formação de colônias. Criamos uma estratégia de imunocaptura através de um anticorpo contra os 14 últimos aminoácidos da Ubiquitina para posterior coleta do imunocomplexo com esferas magnéticas de estreptavidina para análises proteômicas. Nossos dados preliminares apontaram para relação do ubiquitoma com a regulação epigenética, uma vez que verificamos a presença abundante de histonas da família H2A e várias outras proteínas ligadas a regulação de transcrição nas frações testadas. A ubiquitinação de histonas é uma modificação pós-traducional que ocorre em resposta a quebras de fita dupla de DNA (DSBs). A mono-ubiquitinação da lisina 119 da histona H2A (H2AK119ub) é controlada pelo complexo repressivo polycomb 1 (PRC1) através da E3 ligase (RING1A ou RING1B) e é considerado um marcador transcricional repressivo. Aumento de PRC1 é relacionado a malignicidade em vários tipos de câncer. Nesse contexto, voltamos nossa atenção sobre a função da RING1 durante a EMT usando o inibidor PRT4165 para sua modulação. Nos nossos resultados, obtidos por análise proteômica dirigida (MRM), de fato o inibidor PRT4165 diminuiu a ubiquitinação da K119, porém, não foi possível confirmar o caráter supressor do PRT4165 em estudos funcionais de migração e formação de colônias usando o inibidor. Porém, a H2AK119ub pelo PRC1 é reversível através do complexo repressivo PcG deubiquitinase (PR-DUB)/BAP1. Portanto, também testamos o papel do inibidor de deubiquitinases P5091 no status da H2AK119ub e verificamos o inibidor USP7/USP47 P5091 modulou efetivamente a ubiquitilação na lisina 119 de H2A1 e demonstrou um efeito protetor ao reduzir a migração e a formação de colônias em ensaios funcionais.