Avaliação da sinalização de zinco em amostras seminais de touros PRÉ e PÓS Percoll® e correlação com o desenvolvimento embrionário

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2021
Autor(a) principal: Julia de Lima Simões
Orientador(a): Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção
Banca de defesa: Letícia Signori de Castro, Renata Simões
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Universidade de São Paulo
Programa de Pós-Graduação: Reprodução Animal
Departamento: Não Informado pela instituição
País: BR
Link de acesso: https://doi.org/10.11606/D.10.2021.tde-05082021-093518
Resumo: A produção in vitro de embrião (PIVE) em bovinos consiste na maturação do oócito (MIV), fecundação (FIV) e subsequente cultivo in vitro (CIV). Para o sucesso em cada etapa, os gametas precisam de alguns requisitos. Em relação ao espermatozoide, as células precisam ser capacitadas para a fecundação in vitro para gerar o zigoto. O processo de capacitação espermática deixa a célula pronta para a fecundação por meio de alterações funcionais e estruturais resultando em mudanças de permeabilidade na membrana celular, promovendo o influxo de cálcio. Além do cálcio, estudos recentes descreveram a participação do zinco no processo, podendo ser um novo método para avaliar a capacitação espermática. O espermatozoide precisa ser capacitado para fecundar, no entanto, uma capacitação prematura é prejudicial, pois inviabiliza a célula para sua principal função. A manipulação, congelação/descongelação, preparação de espermatozoides para a PIVE e a seleção de células podem ocasionar esta capacitação prematura. Para a FIV, há a necessidade de se separar os espermatozoides com motilidade, sendo o gradiente de densidade Percoll® o mais utilizado em bovinos. Ainda não está claro se a submissão do sêmen a esse gradiente promove a capacitação completa dos espermatozoides, refletindo negativamente na produção in vitro de embriões, sendo este o objetivo do presente estudo. Para tanto, sêmen de 10 touros Nelore, foi submetido (PÓS) ou não (PRÉ) ao gradiente de densidade Percoll®. A motilidade espermática foi avaliada por análise computadorizada (CASA) e a integridade da membrana plasmática (PI) e o potencial de membrana mitocondrial (JC1) por citometria de fluxo. A capacitação espermática foi avaliada por ensaio de fluorescência de clortetraciclina (CTC) e as assinaturas de zinco utilizando a sonda de fluorescência FluoZin™ -3 AM (FZ3). Por fim foi realizado a produção in vitro de embriões utilizando as amostras seminais submetidas ao gradiente Percoll®. Foi realizado a correlação entre as taxas de clivagem, de blastocisto e de desenvolvimento embrionário com as variáveis de capacitação. O grupo PRÉ (não submetido ao gradiente Percoll®) apresentou maior porcentagem de espermatozoides capacitados, quando comparado ao grupo PÓS, que apresentou maior quantidade de espermatozoides não capacitados. O grupo PRÉ apresentou também, maior porcentagem de espermatozoides reagidos na avaliação da CTC e maior porcentagem de espermatozoides com retilinearidade, quando comparados aos espermatozoides submetidos ao gradiente Percoll®. Foi possível observar uma correlação negativa entre a assinatura de zinco (3 e 4) no espermatozoide, que indica células capacitadas, e a taxa de desenvolvimento embrionário in vitro, demostrando que quanto mais células capacitadas PÓS Percoll®, menos embriões são produzidos. O gradiente de densidade Percoll® remove os espermatozoides já capacitados das amostras, confirmado pela maior presença de células não capacitadas após o gradiente. A capacitação de espermatozoides detectada pela assinatura de ZN3 correlaciona negativamente com a taxa de blastocisto e desenvolvimento embrionário.
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spelling info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis Avaliação da sinalização de zinco em amostras seminais de touros PRÉ e PÓS Percoll® e correlação com o desenvolvimento embrionário Evaluation of zinc signaling in seminal samples from bulls PRE and POST Percoll® and correlation with embryonic development 2021-06-02Mayra Elena Ortiz D'Avila AssumpçãoLetícia Signori de CastroRenata SimõesJulia de Lima SimõesUniversidade de São PauloReprodução AnimalUSPBR Capacitação Capacitation Density gradient Gradiente de densidade IVP PIVE A produção in vitro de embrião (PIVE) em bovinos consiste na maturação do oócito (MIV), fecundação (FIV) e subsequente cultivo in vitro (CIV). Para o sucesso em cada etapa, os gametas precisam de alguns requisitos. Em relação ao espermatozoide, as células precisam ser capacitadas para a fecundação in vitro para gerar o zigoto. O processo de capacitação espermática deixa a célula pronta para a fecundação por meio de alterações funcionais e estruturais resultando em mudanças de permeabilidade na membrana celular, promovendo o influxo de cálcio. Além do cálcio, estudos recentes descreveram a participação do zinco no processo, podendo ser um novo método para avaliar a capacitação espermática. O espermatozoide precisa ser capacitado para fecundar, no entanto, uma capacitação prematura é prejudicial, pois inviabiliza a célula para sua principal função. A manipulação, congelação/descongelação, preparação de espermatozoides para a PIVE e a seleção de células podem ocasionar esta capacitação prematura. Para a FIV, há a necessidade de se separar os espermatozoides com motilidade, sendo o gradiente de densidade Percoll® o mais utilizado em bovinos. Ainda não está claro se a submissão do sêmen a esse gradiente promove a capacitação completa dos espermatozoides, refletindo negativamente na produção in vitro de embriões, sendo este o objetivo do presente estudo. Para tanto, sêmen de 10 touros Nelore, foi submetido (PÓS) ou não (PRÉ) ao gradiente de densidade Percoll®. A motilidade espermática foi avaliada por análise computadorizada (CASA) e a integridade da membrana plasmática (PI) e o potencial de membrana mitocondrial (JC1) por citometria de fluxo. A capacitação espermática foi avaliada por ensaio de fluorescência de clortetraciclina (CTC) e as assinaturas de zinco utilizando a sonda de fluorescência FluoZin™ -3 AM (FZ3). Por fim foi realizado a produção in vitro de embriões utilizando as amostras seminais submetidas ao gradiente Percoll®. Foi realizado a correlação entre as taxas de clivagem, de blastocisto e de desenvolvimento embrionário com as variáveis de capacitação. O grupo PRÉ (não submetido ao gradiente Percoll®) apresentou maior porcentagem de espermatozoides capacitados, quando comparado ao grupo PÓS, que apresentou maior quantidade de espermatozoides não capacitados. O grupo PRÉ apresentou também, maior porcentagem de espermatozoides reagidos na avaliação da CTC e maior porcentagem de espermatozoides com retilinearidade, quando comparados aos espermatozoides submetidos ao gradiente Percoll®. Foi possível observar uma correlação negativa entre a assinatura de zinco (3 e 4) no espermatozoide, que indica células capacitadas, e a taxa de desenvolvimento embrionário in vitro, demostrando que quanto mais células capacitadas PÓS Percoll®, menos embriões são produzidos. O gradiente de densidade Percoll® remove os espermatozoides já capacitados das amostras, confirmado pela maior presença de células não capacitadas após o gradiente. A capacitação de espermatozoides detectada pela assinatura de ZN3 correlaciona negativamente com a taxa de blastocisto e desenvolvimento embrionário. The in vitro production (IVP) of bovine embryos consists in oocyte maturation, fertilization and consequent in vitro culture. For the success in each step, gametes need some requisites. Concerning the sperm, cells need to be capacitated for in vitro fertilization to generate the zygote. Sperm capacitation process makes the cell ready for fertilization by functional and structural alterations resulting in permeability changes on cell membrane, which promotes calcium influx. Nevertheless, recent studies described zinc as a new method to assess sperm capacitation. Sperm needs to be capacitated to fertilize, but a premature capacitation is harmful for the process. The manipulation, freezing/thawing, sperm preparation for IVP and cell sorting may be involved with this premature capacitation. For IVP viable cells must be separated form the extender and dead cells, being Percoll® gradient the most used in bovine. It is not yet clear if the submission of semen to a Percoll® gradient promotes complete sperm capacitation, reflecting on in vitro embryo production, being this the objective of this study. For that, semen of 10 Nelore Bulls, used on in vitro embryo production were submitted (POST) or not (PRE) to a Percoll® gradient. Sperm motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA) and sperm plasmatic membrane integrity (PI), mitochondrial membrane potential (JC1) by Flow Cytometry. Sperm capacitation was evaluated by chlortetracycline fluorescence assay (CTC) and zinc assay with fluorescence probe FluoZin™ -3 AM (FZ3). Finally, in vitro embryo production was performed using seminal samples submitted to the Percoll® gradient. A correlation between cleavage rate, blastocyst rate and the embryo development rate with the sperm capacitation variables was performed. Semen not submitted to Percoll® gradient presented higher percentage of capacitated sperm, higher percentage of reacted spermatozoa in CTC evaluation, and higher percentage of sperm with rectilinearity when compared to sperm submitted to Percoll® gradient. In addition, sperm submitted to Percoll® gradient, had a higher percentage of non-capacitated cells when compared to sperm not submitted to Percoll® gradient. We observed a negative correlation between sperm Zinc signature (3 and 4) that indicate capacitated cells and in vitro embryo development rate, showing that the more capacitated cells, less embryos are produced. Percoll® gradient removes sperm already capacitated from samples, confirmed by the presence of non-capacitated spermatozoa after submitting sperm to Percoll® gradient. This condition seems to be important for bovine in vitro fertilization and subsequently success of bovine in vitro embryo production. https://doi.org/10.11606/D.10.2021.tde-05082021-093518info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USP2023-12-21T18:16:29Zoai:teses.usp.br:tde-05082021-093518Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212021-11-29T17:33:02Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false
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