Explorando novas facetas da interação entre a Enzima Clorocatecol 1,2-dioxigenase e seus ligantes

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Furtado, Natasha Faiani
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Bioremediation; Biorremediação; chlorocatechol 1,2-dioxygenase enzyme kinetics; cinética enzimática; Clorocatecol 1,2- dioxigenase; interação com membranas; interaction with membranes.; Pseudomonas putida
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60136/tde-18112014-084221/

O uso intensivo de produtos organoclorados contendo estruturas aromáticas em sua composição tem crescido de forma rápida nos últimos anos em face de sua ampla utilização em vários setores da indústria moderna. A decomposição de tais compostos é lenta, dada sua grande estabilidade química, tornando-os poluentes recorrentes do meio-ambiente. Diferentes estratégias estão disponíveis para tentar solucionar este problema. Os chamados processos de bioremediação estão entre elas e vem ganhando espaço dentre as possíveis escolhas em face de sua maior eficiência e por estarem baseados no uso de moléculas como enzimas, que não afetam o ambiente, para realizar a tarefa de degradação de substâncias tóxicas. Neste contexto se coloca a enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida, alvo de estudos deste trabalho. Nosso grupo tem trabalhado no entendimento do mecanismo de ação da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida há alguns anos já que acreditamos que a utilização de forma mais eficiente e efetiva possível da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida passa necessariamente pelo conhecimento acerca de maneiras de controle da atividade enzimática. Com isso, os resultados obtidos consistiram na otimização dos processos de expressão e purificação que permitiram a obtenção da proteína pura e com bom rendimento, após mudança no vetor de expressão. Foram feitos ensaios de atividade enzimática com diferentes substratos e desenvolvimento de um protocolo de caracterização cinética, para assim avaliar a existência de mecanismos de inibição/modulação da reação pelo substrato e/ou produto. Análise da estrutura secundária por meio de dicroísmo circular e dicroísmo circular com radiação síncrotron para avaliar a integridade estrutural frente da nova construção. Também foram realizados testes para separação dos ligantes enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas putida para análise em espectrômetro de massas afim de se identificar as moléculas anfipáticas que podem estar presentes em seu sítio hidrofóbico. Por fim, ensaios de interação proteína-lipídio utilizando calorimetria diferencial de varredura, ressonância paramagnética eletrônica e dicroísmo circular indicam uma provável interação com modelos de membrana, principalmente, quando na presença de PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato).