β-D-galactofuranosidase: Purificação da enzima de Penicillium fellutanum e sua detecção em Trypanossoma cruzi

• Ano de defesa: 2001
• Autor(a) principal: Miletti, Luiz Claudio
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Biologia celular; Carbohydrates (Biosynthesis); Carboidratos (Biossíntese); Cell biology; Chagas disease; Doença de chagas; Galactofuranose; Galactofuranosidase; Galactofuranosis; Penicillium (Biossíntese); Penicillium (Biosynthesis); Penicillium fellutanum; Trypanosoma cruzi (Biossíntese); Trypanosoma cruzi (Biosynthesis)
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-31012019-093632/

A β-D-galactofuranose é um componente de várias macromoléculas de muitos organismos, incluindo bactérias, protozoários e fungos. Interessantemente este carboidrato não usual está ausente de glicoconjugados de mamíferos. Um método alternativo foi utilizado para purificar a β-D-galactofuranosidase utilizando p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. O meio de cultura concentrado do fungo Penicillium fellutanum foi cromatografado em coluna de DEAE-Sepharose CL 6B, seguido de cromatografia em coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose, que permitiu a separação de dois picos com atividade enzimática após a eluição com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de 100 a 500 mM de NaCl. Os dois picos resultaram, quando analisados por SDS-PAGE, em um polipeptídeo de 70 kDa. Anticorpos produzidos contra a mistura das bandas recortadas do gel são capazes de imunoprecipitar 77 % das unidades totais de enzima. Uma das bandas recortadas foi submetida a microseqüenciamento, obtendo-se seqüências para 3 peptídeos (65, 73, 101). Anticorpos foram produzidos contra os peptídeos sintéticos e usados para imunoprecipitar um polipeptídeo com atividade de β-D-galactofuranosidase. Para verificar a presença de β-D-galactofuranosidase em T. cruzi, usamos a mesma coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose. Um extrato de formas epimastigotas marcadas metabolicamente com 35S-metionina foi aplicado na coluna de afinidade. A enzima foi eluída após a lavagem com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de NaCl 100 a 500 mM. A análise por SDS-PAGE do material eluido mostrou um polipeptídeo de massa molecular aparente 50-60 kDa que é reconhecido por anticorpos anti-β-D-galactofuranosidase. Os anticorpos reagem por imunoflorescência indireta também com parasitas fixados com paraformaldeído. O polipeptídio de 50-60 kDa foi empregado em ensaios de atividade enzimática. Praticamente nenhuma atividade foi detectada utilizando-se p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. A LPPG (lipopeptideofosfoglicana), um glicoconjugado isolado de epimastigotas de T. cruzi foi empregada como substrato. A galactopiranose, produto da hidrólise da atividade enzimática, foi detectada por cromatografia de troca iônica em alto pH sugerindo a presença de β-D-galactofuranosidase em T.cruzi.