Análise de interferentes na extração, amplificação e detecção de M. tuberculosis por reação de PCR em amostras de líquido pleural, escarro e lavado broncoalveolar

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: Carnevale, Gabriela Gaspar
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Body fluid; Bronchoalveolar lavage; Escarro; Extracellular fluid; Fluid; Lavagem broncoalveolar; Líquido extracelular; Líquidos; Líquidos corporais; Polymerase chain reaction/methods; Reação em cadeia da polimerase/métodos; Sputum; Tuberculose; Tuberculosis
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5150/tde-12012016-090128/

Introdução: A tuberculose (TB) é uma das infecções mais prevalentes na humanidade, sendo o comprometimento pulmonar a principal causa de morbimortalidade. A cultura é o padrão de referência para diagnóstico, porém apresenta baixa sensibilidade. Das formas extrapulmonares, a TB pleural é a mais comum e apresenta diagnóstico confirmatório difícil por ser paucibacilar e conter interferentes intrínsecos na amostra. A reação em cadeia da polimerase (PCR), por amplificar o DNA da micobactéria, apresenta-se como teste mais sensível que a cultura, sendo positivo em amostras que apresentam a partir de 102 UFC/mL (unidades formadoras de colônia por mL) de M. tuberculosis (MTB). Entretanto, quando utilizada em amostras de escarro, lavado broncoalveolar e/ou líquido pleural pode ter seu desempenho comprometido pela presença de inibidores intrínsecos da amostra (variáveis pré-analíticas) e pelas técnicas de amplificação e detecção (variáveis analíticas) utilizadas na reação. Objetivo: Avaliar a influência de variáveis pré-analíticas (concentração de células, hemácias e proteínas) na detecção do DNA do M. tuberculosis em amostras de escarro, lavado broncoalveolar (LBA) e líquido pleural (LP), utilizando combinações de métodos de extração/detecção. Métodos: Amostras de escarro, lavado broncoalveolar e líquido pleural de pacientes não infectados pelo M. tuberculosis foram obtidas através de indução à expectoração, broncoscopia respiratória e/ou toracocentese, respectivamente, em volumes suficientes para o estudo. Para testar o limiar de detecção do M. tuberculosis, as amostras foram preparadas \"in vitro\" de maneira a conter concentrações variadas dos interferentes pré-analíticos e de UFC/mL da micobactéria. Para a técnica de PCR, o DNA foi extraído pelo método de extração QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) e pelo AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) e amplificado e detectado por três métodos: 1) COBAS® TaqMan® MTB Test (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA); 2) MTB Q - PCR Alert Kit (Nanogen Advanced Diagnosis, Trezzano, Italy) e 3) \"in-house\" ou caseiro. Desta maneira, foram testadas as seguintes combinações: Extração Roche/detecção Roche (R/R); Extração Roche/detecção Nanogen (R/N); Extração Roche/detecção \"in house\" (R/IH); Extração Qiagen/detecção Roche (Q/R); Extração Qiagen/detecção Nanogen (Q/N) e Extração Qiagen/detecção \"in house\" (Q/IH). Resultados: Em amostras de escarro, a quantidade de células e de hemácias não interferiu na detecção do M. tuberculosis, com exceção do método de extração/detecção Roche. Nas amostras de LBA, médias e altas concentrações de células e altas concentrações de hemácias contribuíram para menor detecção do MTB quando utilizado o método de detecção Roche, enquanto que no líquido pleural, a concentração de hemácias foi a variável que mais interferiu na detecção do agente. Em ambas as situações a menor detecção foi obtida com a combinação Q/N. Conclusão: A qualidade pré-analítica das amostras biológicas recebidas no laboratório clínico pode interferir no desempenho diagnóstico dos testes moleculares. A escolha dos métodos de extração e detecção é de fundamental importância na sensibilidade analítica do teste, para garantia de melhores resultados, especialmente quando trabalhamos com amostras paucibacilares que contém potenciais inibidores da reação