Clonagem, identificação e sequenciamento de um gene de resistência a nistatina de Saccharomyces cerevisiae

• Ano de defesa: 1997
• Autor(a) principal: Almeida, Juan Lucas Argüeso Gomes de
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: ANTIBIÓTICOS; CLONAGEM; ESISTÊNCIA GENÉTICA; LEVEDURAS; SEQUENCIAMENTO GENÉTICO
• Link de acesso: http://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20181127-160038/

O híbrido de Saccharomyces cerevisiae M606 é uma levedura de aplicação industrial que alia alta capacidade de produção de etanol a resistência ao antibiótico poliênico nistatina. Com o objetivo de isolar o gene que confere a esse organismo a capacidade de se multiplicar na presença dessa substância, tóxica a leveduras e à maioria dos fungos, foi construída uma biblioteca genômica com o DNA de uma linhagem segregante de M606, M606.1c. Um plasmídio epissomal de levedura contendo um fragmento genômico da biblioteca de 5900 pares de bases foi capaz de conferir resistência a linhagens sensíveis quando introduzido por transformação. A determinação da sequência de nucleotídeos desse fragmento de DNA, designado NYS1, permitiu a sua localização no braço longo do cromossomo XIV de Saccharomyces cerevisiae. A subclonagem do fragmento NYS1 revelou que o gene responsável pela resistência é o quadro de leitura aberta (ORF) conhecido como YNL231C, que passa a ser denominado NYS, gene de resistência a nistatina de Saccharomyces cerevisiae. O gene NYS foi subclonado em um fragmento de 1337 pares de bases, que foi nomeado NYS3. Esse plamídio foi utilizado para transformar linhagens sensíveis, conferindo-lhes resistência. Sua sequência de nucleotídeos foi integralmente determinada e comparada com o Banco de Dados de Genoma de Saccharomyces cerevisiae para a identificação das diferenças ao nível do DNA entre os mutantes NYS e o tipo selvagem sensível a nistatina. Não foram identificadas diferenças de sequência entre o tipo selvagem e o gene clonado. Esse dado sugere que o gene clonado não é o mesmo que é responsável pela resistência de M606.1c. M606.1c apresentou o derivado de ergosterol cholesta-5,7,22,24-tetraenol, que parece estar ligado à resistência. As leveduras transformadas com o gene NYS não apresentaram a formação desse composto, sendo este mais um dado que sugere a clonagem de um segundo gene de resistência. A provável explicação para a resistência conferida por um gene selvagem seria o alto número de cópias em que ele se apresenta nos transformantes. O desequilíbrio na dosagem do produto gênico de NYS, possivelmente teria tido como efeito alguma alteração na membrana plasmática que levou à resistência a nistatina