PEGuilação sítio dirigida de uma L-asparaginase glicosilada de Erwinia chrysanthemi.

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Brandão, Gustavo Henrique Azevedo
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Bioprocessos; Crisantaspase, PEGylation; Engenharia química; L-asparaginase; PEGuilação; Pichia pastoris GlycoSwitch®; Proteínas recombinantes; Termoestabilidade; Thermodynamic and thermostability
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-09012026-104711/

Atualmente, as formulações de L-asparaginase (ASNase) são produzidas a partir de espécies de bactérias e apresentam significativa resposta de hipersensibilidade e meia-vida curta para tratamentos de leucemia linfoblástica aguda. A pegaspargase (Oncaspar®) é uma ASNase PEGuilada que superou alguns dos problemas terapêuticos atribuídos à ASNase nativa, uma vez que a forma PEGuilada reduziu drasticamente a atividade imunogênica e aumentou o tempo de circulação na corrente sanguínea. O processo de PEGuilação é uma ferramenta importante para melhorar o perfil de qualidade dos biofármacos. Contudo, a Oncaspar® é obtida por reação de PEGuilação aleatória, produzindo variações lote-a-lote, o que são indesejáveis para controle de qualidade de produção de biofármaco. A crisantaspase (CRIS), ASNase de Dickeya chrysanthemi, é uma alternativa terapêutica promissora para pacientes refratários aos tratamentos com ASNase, sendo que previamente Pichia pastoris GlycoSwitch® foi utilizada como sistema de expressão para produzir uma crisantaspase com um padrão de glicosilação humanizada. Neste trabalho, as linhagens P. pastoris HIS+ e HIS- foram comparadas por meio de ferramentas estatísticas no que tange à eficiência na produção de biomassa, proteínas totais e enzima CRIS; para uma mesma concentração celular a linhagem P. pastoris HIS+ produziu um valor médio expressivamente maior. Assim, produzimos e purificamos a CRIS pelo cultivo de P. pastoris GlycoSwitch® e realizamos uma PEGuilação sítio dirigida na região N-terminal da enzima, com o objetivo de colaborar com o projeto temático Fapesp (Processo 13/08617-7) para produção nacional de uma ASNase com melhores propriedades físico-químicas, farmacocinéticas, termodinâmicas e biológicas. Em colaboração com esse projeto, esta tese objetiva também realizar os ensaios termodinâmicos para avaliar os efeitos da PEGuilação na temperatura ótima e na termoinativação e desnaturação irreversível de proteoformas obtidas por meio de PEGuilação sítio dirigida N-terminal da CRIS com os derivados m-PEG-NHS (20 kDa) de cadeia linear e ramificado. A partir dos resultados desses ensaios termodinâmicos foi sugerido que a adição de quatro cadeias de PEG à enzima crisantaspase glicosilada contribuiu com o aumento da variação de entalpia de desnaturação (H°u) e não prejudicou de forma expressiva a mobilidade conformacional. O processo de glicosilação diminuiu o acesso do PEG a região N-terminal, e por sua vez, o rendimento. Os resultados sugerem que o processo de glicosilação também aumentou a estabilidade CRIS-PEGLinear, em temperatura de refrigeração à 4°C. Em condições fisiológicas à 37°C uma maior densidade eletrônica conferida ao PEGRamificado preveniu flutuações conformacionais induzidas pelo calor. A viabilidade terapêutica da CRIS-PEGRamificada a torna promissora quando consideramos a possibilidade do desenvolvimento de uma formulação para melhorar a estabilidade em condições refrigeradas; assim, contribuiu para o desenvolvimento de L-asparaginases inovadoras com potencial de se tornarem biofármacos com produção nacional.