"Contribuição ao imunodiagnóstico da leptospirose humana: ênfase ao uso de anticorpos monoclonais"

• Ano de defesa: 2003
• Autor(a) principal: Ribeiro, Maricy Alves
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: antibodies; anticorpos; anticorpos monoclonais; human leptospirosis; immunodiagnosis; imunodiagnóstico; leptospirose humana; monoclonal antibodies
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-15032004-161427/

A prova sorológica de referência na leptospirose ainda é a soroaglutinação microscópica (SAM). Devido à complexidade desta prova avaliamos alguns testes rápidos para triagem dos anticorpos anti-leptospiras na fase aguda da infecção. Na década de 80, uma hemaglutinação passiva, utilizando frações polissacarídicas de leptospiras, foi considerada apropriada ao diagnóstico precoce, porém esta preparação antigênica incluía muitos “antígenos comuns" reconhecidos por anticorpos de 4% dos indivíduos normais. Um novo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) utilizando uma suspensão de antígenos imunodominantes, resistentes à proteinase K, foi padronizado e avaliado quanto ao seu valor diagnóstico. Com 89,9% de sensibilidade e 97,4% de especificidade, esta técnica, referida como PK-ELISA, satisfaz os requisitos necessários para as provas de triagem da leptospirose humana. No entanto, em virtude de alguns reagentes usados nesta preparação antigênica serem importados e muito instáveis, foi proposta a introdução de novos métodos empregando-se anticorpos monoclonais. Em um “Acordo de Pesquisa Cooperativa" entre o Instituto Adolfo Lutz e o Laboratório Fleury foram produzidos hibridomas contra leptospiras. Dois deles foram selecionados para dar continuidade ao estudo: um, secretando anticorpos monoclonais (AcM) para um epítopo detectado em 16 de 23 sorovares do gênero Leptospira mais freqüentes em nosso meio (clone A12P4), e outro específico a somente um sorogrupo patogênico, icterohaemorragiae (clone H7P1). O AcM A12P4, uma imunoglobulina G2B (IgG2B), reagiu com epítopo presente nos componentes de pesos moleculares (PM) de 16-18 kDa dos lisados de leptospiras das cepas RGA e M-20, quando separados na eletroforese em gel de poliacrilamida, e com componentes de PM de 75-84kDa dos sorovares copenhageni e canicola. Por sua vez, o AcM H7P1, uma imunoglobulina G, reagiu com um epítopo comum a várias frações de PM acima de 21 kDa da cepa RGA e com componentes de PM de 21-22 kDa e de 75-82 kDa da cepa M-20. Os monoclonais foram empregados em provas imunoenzimáticas para a detecção de anticorpos específicos em amostras séricas pareadas coletadas de 52 pacientes com leptospirose, e do grupo controle que incluiu amostras séricas de 57 pacientes com outras doenças consideradas no diagnóstico diferencial, e de 68 indivíduos normais. Estas provas, no entanto, não foram satisfatórias. Finalmente, um novo ELISA foi desenvolvido no presente estudo que utiliza a suspensão de antígenos “AgMc", purificados por cromatografia de afinidade utilizando a Sepharose 4B ativada com CNBr acoplada aos anticorpos monoclonais descritos acima. Os resultados obtidos com esta prova foram comparados aos obtidos com outros testes disponíveis em nosso meio, como a SAM e o ELISA clássico (ELISA c). Este novo método, o “ELISA AgMc", com 80,70 % e 83,33 % de sensibilidade e especifidade, respectivamente, em relação à SAM; valores preditivos positivo e negativo de 69,70% e 90,10% respectivamente e índice de concordância geral de 82,49%, não parece ser um protocolo promissor para o diagnóstico rápido na leptospirose humana. Além disso, tomando-se a SAM como diagnóstico verdadeiro, os resultados obtidos no novo teste, após a conclusão diagnóstica do grupo de pacientes com a leptospirose, mostrou uma discordância significativa. São discutidas as possíveis explicações para os resultados encontrados.