Descoberta e exploração biocatalítica de ene-redutases fúngicas

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Damada, Pedro Henrique
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: biocatálise; biocatalysis; ene-reductase; ene-redutase; fungi; fungos; OYE
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-25102024-113306/

Old Yellow Enzymes (OYEs) catalisam a redução de ligações duplas em compostos α,β-insaturados, especialmente aqueles contendo grupos retiradores de elétrons, o que é relevante para a síntese de compostos enantiomericamente puros. OYEs oferecem vantagens sobre catalisadores químicos devido à sua alta enantioseletividade e estereosseletividade, juntamente com sua capacidade de agir em condições brandas. A identificação da primeira OYE data de 1932, e esforços contínuos na pesquisa revelaram variantes adicionais originárias de diversas fontes. Dentro desse conjunto, certas enzimas apresentam arranjos estruturais e propriedades funcionais distintas. Para agrupar essas enzimas, elas foram classificadas em sete categorias com base em características de sequência e estrutura. Este trabalho concentrou-se em OYEs provenientes de fungos, incluindo Penicillium citrinum CBMAI 1186 e Penicillium steckii (ambas espécies mesofílicas), bem como Aspergillus thermomutatus, Chaetomium thermophilum, Lachancea thermotolerans, Ogataea polymorpha e Thermothielavioides terrestris (todas espécies termofílicas). Para o estudo envolvendo P. citrinum CBMAI 1186, reações com células integras foram realizadas para reduzir cinco compostos α,β,γ,δ-insaturados os quais compartilham um motivo estrutural comum: dois anéis de benzeno conectados por cinco átomos de carbono, com um átomo de carbono ligado a um grupo carbonila e dois pares de átomos conectados por dupla ligação. A característica distintiva entre eles é o grupo substituinte localizado na posição para no anel adjacente ao grupo carbonila, sendo bromo-, cloro-, flúor-, metil- e nitro os grupos. Altas conversões foram alcançadas para compostos contendo grupos flúor e metil, com valores de até 90% de conversão em um período de reação de 3 dias. Para P. steckii, onze genes codificadores de OYE foram selecionados, resultando na expressão e purificação de seis enzimas (PsOYE1-6). Essas enzimas foram classificadas em três classes: Classe II (PsOYE1, PsOYE4 e PsOYE6), Classe III (PsOYE2 e PsOYE3) e Classe V (PsOYE5). Todas as enzimas exibiram temperatura de desnaturação abaixo de 50°C, faixa de pH ótimo de 6-7, preferência por NADPH e alta atividade em relação à p-benzoquinona. Especificamente, PsOYE2 e PsOYE3 mostraram a maior afinidade (0,002 e 0,008 mM, respectivamente) e eficiência catalítica (kcat/KM = 2500 mM-1s-1) para este composto. PsOYE2 também teve sua estrutura elucidada por cristalografia. Com o intuito de expandir o repertório de OYEs robustas, fungos termofílicos foram explorados, resultando na produção e caracterização de cinco OYEs termoestáveis (AtOYE, CtOYE, LtOYE, OpOYE e TtOYE). Todas as enzimas exibiram preferência por NADPH e faixa de pH ótimo de 6-7. AtOYE apresentou atividade para todos os substratos testados, enquanto TtOYE exibiu a maior eficiência catalítica para maleimida (kcat/KM = 3300 mM-1s-1) e p-benzoquinona (kcat/KM = 60mM-1s-1). CtOYE e OpOYE apresentaram as maiores temperaturas de desnaturação (>60°C). A influência do solvente orgânico e do pH na temperatura de desnaturação também foi investigada, revelando que o dimetilsulfóxido foi menos prejudicial. Em pH 4, a temperatura de desnaturação sofreu maior redução. Além disso, das novas OYEs descobertas, quatro (AtOYE, PsOYE3, PsOYE4 e PsOYE5) foram selecionadas para conversões de células inteiras usando Escherichia coli com os compostos α,β,γ,δ-insaturados e R-carvona previamente testados. O uso de um sistema bifásico (hexano 2% v/v) aumentou os valores de conversão em quatro vezes. Notavelmente, ao usar R-carvona, o excesso diastereomérico (d.e.) obtido foi inferior a 80% para todas as reações, em comparação com as enzimas isoladas que atingiram >99%. Em resumo, este trabalho teve como objetivo obter, caracterizar e aplicar OYEs fúngicas para contribuir com novas perspectivas sobre este grupo de enzimas, enriquecendo o repertório disponível para a biocatálise e expandindo as perspectivas para futuras aplicações.