Estudo de ORC1/CDC6 de Trypanosoma cruzi

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Pereira, Murilo Leão
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Chagas disease; Complexo pré-replicação; Doença de Chagas; Pre-replication complex; Replicação; DNA; Replication. DNA
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-08082023-112546/

A replicação do material genético é essencial para a manutenção e propagação da vida. No caso do DNA em eucariotos, esse processo se inicia pelo Complexo Pré- Replicação (pre-RC). Para sua formação, ocorre o reconhecimento de Origens de Replicação (ORIs) no genoma pelo ORC1-6, seguido da ligação aos fatores de licenciamento CDC6 e CDT1 e recrutamento da helicase MCM2-7. O parasita responsável pela doença de Chagas Trypanosoma cruzi apresenta apenas ORC1 do hexâmero de reconhecimento de ORI e essa proteína é intimamente relacionada em sequência a CDC6. A predição da estrutura de TcORC1/CDC6 por diferentes métodos computacionais, seu estudo filogenético em protozoários e preliminar ensaios biofísicos foram o foco do trabalho. Os modelos estruturais gerados por I-TASSER, Robbeta, AlphaFold2 e homologia compartilharam grande similaridade principalmente no provável sítio ativo da proteína, e a comparação dos modelos indicou AlphaFold2 como o método com melhor predição. Consultas comparativas de estruturas proteicas evidenciaram a qualidade da predição. As análises filogenéticas traçaram um histórico evolutivo para a proteína e apontaram em nível molecular divisões que são biologicamente válidas. Os experimentos de expressão e purificação da proteína apresentaram dificuldade em manter a sua estabilidade. Por fim, a identificação de TcORC1/CDC6 pelo anticorpo anti-ORC1 apontou incorretamente a Proteína de Ligação à Maltose (MBP), e isso culminou na caracterização biofísica ter sido realizada com uma molécula diferente da de interesse. Os resultados abrem caminho para uma futura caracterização biofísica e estrutural de TcORC1/CDC6 e para o melhor entendimento da via de replicação no parasita.