Caracterização funcional e estrutural de peroxidases dependentes de tiól da bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Horta, Bruno Brasil
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Xylella fastidiosa; alkyl hydroperoxide reductase subunit C (AHPC); Alquil hidroperóxido redutase su; Bacterioferritin comigratory protein (Bcp); Peroxiredoxin; Peroxirredoxina; Proteína comigratória com bacterioferritina
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41131/tde-14082009-101947/

A bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa é o agente etiológico da Clorose Variegada dos Citros (CVC), que causa perdas anuais estimadas em US$ 100 milhões no Brasil. Durante o processo infeccioso, a geração extracelular de espécies ativas de oxigênio é um dos principais mecanismos de defesa da planta contra o patógeno. Em contrapartida, para se defender do estresse oxidativo imposto pelo hospedeiro, os fitopatógenos possuem mecanismos de defesa que incluem enzimas antioxidantes, como as peroxirredoxinas, alquil hidroperóxido redutase subunidade C (AhpC) e proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp). As peroxirredoxinas são proteínas que utilizam suas cisteínas ativas para catalisar a redução de hidroperóxidos. Por análise proteômica, os produtos dos genes ahpc e bcp foram identificados no extrato celular protéico de X. fastidiosa (Smolka e col., 2003). Com o intuito de caracterizar funcional e estruturalmente as proteínas AhpC e Bcp de X. fastidiosa, clonamos e expressamos seus respectivos genes em Escherichia coli e purificamos as proteínas por cromatografia de afinidade a níquel. As proteínas recombinantes apresentaram atividade dependente de tiól de redução de peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos. A atividade peroxidase da AhpC e Bcp são dependentes, respectivamente, de alquil hidroperóxido redutase subunidade F (AhpF) e do sistema tiorredoxina. Paradoxalmente, a flavoproteína AhpF possui atividade NAD(P)H oxidase, que resulta na produção de peróxido de hidrogênio. As constantes de segunda ordem da reação das proteínas com peróxido de hidrogênio (da ordem de 107 M-1.s-1), determinadas pelo ensaio de cinética competitiva com peroxidase de raiz forte, indicam que ambas possuem atividades peroxidase equivalentes às apresentadas por glutationa peroxidases dependentes de selênio e catalases, ao contrário do descrito na literatura. Por SDS-PAGE não-redutor e pela quantificação de cisteínas livres por DTNB, verificamos que as proteínas possuem mecanismos catalíticos distintos: AhpC é uma 2-Cys Prx típica (com formação de ponte dissulfeto intermolecular), enquanto Bcp é uma 2-Cys Prx atípica (com formação de ponte dissulfeto intramolecular). Para AhpC, a atividade catalítica envolve as cisteínas conservadas (Cys-47 e Cys-165), em contraste, apenas através de estudos de mutação sítio-dirigida e espectrometria de massas conseguimos identificar os resíduos de cisteínas envolvidos na atividade catalítica da Bcp (Cys-47 e Cys-83). A caracterização estrutural de AhpC por cromatografia de exclusão molecular e espalhamento dinâmico de luz mostram que a proteína nativa é um decâmero estável, independentemente do estado de oxidação de suas cisteínas. A caracterização da estrutura cristalográfica de Bcp C47S, inédita para 2-Cys Prx atípicas que possuem as cisteínas ativas separadas por 35 aminoácidos, indica que a proteína possui o enovelamento característico das peroxirredoxinas e que as cisteínas ativas estão localizadas a uma distância média de 12,4 Å. Baseado em dicroísmo circular, apresentamos dados que indicam que a aproximação das cisteínas deve envolver um significativo rearranjo estrutural, que provavelmente se inicia com a formação do intermediário ácido sulfênico na cisteína peroxidásica (Cys-47). Assim, conseguimos elucidar o papel catalítico dessas proteínas, bem como identificar seus sistemas redutores, obtendo informações que podem ser relevantes para o entendimento do mecanismo da patogenicidade da X. fastidiosa. Os resultados apresentados neste trabalho podem contribuir para o desenvolvimento de novas técnicas de controle de praga para a doença CVC em citrus e outras que envolvam a bactéria X. fastidiosa.