Transferência direta de genes para plantas de Stylosanthes guianensis (Aubl.) Sw.

• Ano de defesa: 1999
• Autor(a) principal: Quecini, Vera Maria
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: ESTILOSANTE; TRANSFERÊNCIA DE GENES
• Link de acesso: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20210104-194445/

O presente trabalho teve por objetivo otimizar as condições físicas, químicas e biológicas envolvidas na transformação direta de plantas de Stylosanthes guianensis cv. Mineirão, uma leguminosa forrageira tropical. Foram estudadas a transformação genética por bombardeamento de micropartículas e por eletroporação de tecidos íntegros e protoplastos visando à introdução de um gene quimérico que codifica a albumina 2S do castanheiro do Pará (Bertholletia excelsa) dirigido pelo promotor atsl A da subunidade menor da rubisco de Arabidopsis thaliana, restringindo a expressão a tecidos clorofilados. A fonte de explante, a pressão de gás hélio, a distância de vôo das micropartículas, a distância entre o gerador de onda de choque até a tela de retenção e distância de vôo da membrana macrocarreadora foram os parâmetros avaliados na transformação por biobalística. A análise da expressão transiente do gene repórter uid A foi usada para verificar a eficiência de transformação nos explantes bombardeados. Calos organogênicos 30 a 45 dias após a indução foram os explantes que promoveram níveis mais elevados de expressão transiente. As frequências mais elevadas de transformação foram observadas utilizando-se : 1200 psi de gás hélio, 12, 5 cm de distância de vôo dos microprojéteis, 10 a 20 mm de distância entre a membrana macrocarreadora e a tela de retenção e 1o a 20 mm de distância entre a membrana de ruptura e o macrocarreador. A eficiência de transformação por eletroporação de tecidos intactos foi igualmente avaliada pela expressão de GUS. A fonte de explante e a intensidade do campo elétrico foram os fatores que tiveram influência mais decisiva sobre a eficiência de transformação, sendo que o melhor explante foi cotilédone e campos elétricos de 100 a 250 V.cm -1 promoveram alta frequência de explantes GUS positivo. O uso de tampão de eletroporação sem íons cloreto, de DNA plasmidial linearizado e o pré-tratamento dos explantes com 1,6 M de manitol como agente osmótico aumentaram, porém de forma não significativa, a expressão de GUS. O gene mgfp 5, que codifica a proteína fluorescente verde (GFP) foi empregado como repórter in vivo para a eletroporação de protoplastos de S. guianensis. Capacitores de 1000 µF descarregando campos elétricos de 100 a 250 m. V-1 à suspensão de protoplastos em tampão sem íons cloreto promoveram níveis mais altos de expressão transiente de GFP. O uso de DNA plasmidial linearizado também promoveu um aumento na eficiência de transformação. Transformantes estáveis de S. guianensis cv. Mineirão foram obtidos via eletroporação de protoplastos e biobalística. A eficiência de transformação, de 3,47 % e 36 % para biobalística e eletroporação de protoplastos, respectivamente, pode ser considerada elevada quando comparada aos valores relatados para a transformação de leguminosas. A inserção estável do transgene foi confirmada por hibridização de ácidos nucléicos utilizando sonda específica para a unidade de transcrição na planta do vetor de transformação pEA ats:2S. A expressão do transgene foi confirmada pela detecção de transcritos do BE2S1 por análise de Northern blot e por imunodetecção da proteína 2S em tecidos foliares de estilosantes. Há evidências de que a albumina 2S de B. excelsa é corretamente processada e transportada para corpos protéicos de armazenamento em folhas de plantas transgênicas de S. guianensis.