Purificação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase por sistemas micelares de duas fases aquosas contendo ligantes de afinidade

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Lopes, André Moreni
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Enzima; Enzyme; Micellar systems; Protein; Proteína; Sistemas micelares; Tensoativos
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9135/tde-17042006-125406/

O presente trabalho teve como objetivo a purificação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase pela tecnologia de extração líquido-líquido em Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA). Estes sistemas são constituídos por soluções de tensoativos contendo micelas e oferecem ambientes hidrofóbico e hidrofílico, o que possibilita seletividade na partição da enzima de acordo com sua hidrofobicidade e proporciona um ambiente ameno às biomoléculas. Foram estudados alguns dos fatores que influenciam a partição da G6PD, como: tipo e concentração de diferentes agentes tensoativos não-iônicos (C10E4 e Triton X-114), temperatura e adição de ligantes de afinidade (cibacron blue e procion red) e o efeito da adição dos sais sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e sulfato de sódio (Na2SO4). Estudou-se ainda a síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue. Em todos os ensaios a enzima foi recuperada preferencialmente na fase diluída, pobre em micelas, tanto em sistema Triton X-114/tampão como para C10E4/tampão, no qual existe maior volume disponível, resultando em valores de KG6PD inferiores a 1. A utilização dos ligantes de afinidade na partição da G6PD nos sistemas descritos proporcionou um pequeno aumento nos valores de KG6PD da enzima, porém com valores inferiores a 1. Os sistemas Triton X-114/Sal não influenciaram a partição da enzima para a fase micelar, apesar da existência da diferença de potencial eletrostático entre as fases destes sistemas. O efeito desempenhado pelo volume de exclusão foi dominante em todos os sistemas estudados e, portanto, a enzima foi predominantemente excluída para a fase aquosa, pobre em micelas. A tecnologia por SMDFA para a purificação do homogeneizado celular de Saccharomyces cerevisiae demonstrou ser eficiente em recuperar a biomolécula alvo na fase aquosa, pobre em micelas, permitindo separar da presença de biomoléculas ou mesmo de contaminantes com caráter hidrofóbico. Dessa forma, o SMDFA pode ser empregado como uma possível etapa de purificação num processo biotecnológico.