Estudos espectroscópicos da meta-hemoglobina e globina de Glossoscolex paulistus

• Ano de defesa: 1995
• Autor(a) principal: Agustinho, Sylvana Cardoso Miguel
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Glossoscolex paulistus; espectroscopia; espectroscopia UV-Vis; globin; globina; meta-hemoglobina; methemoglobin; spectroscopy; UV-Vis spectroscopy
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75131/tde-14082025-073505/

Neste trabalho foi feita a obtenção e a caracterização da meta-hemoglobina de Glossoscolex paulistus através da cromatografia em Sephadex G-200 em pH 7,0 e pH 9,0. Em pH 7,0 obtém-se uma única fração no volume de exclusão correspondente à proteína íntegra (PM ≅ 3 × 103 kDa), enquanto que em pH 9,0 duas subunidades são obtidas correspondentes ao trímero (PM = 54 kDa) e monômero (PM = 12 kDa). A proteína íntegra (pH 7,0), bem como suas subunidades (pH 9,0), foram estudadas através de medidas de absorção ótica e emissão de fluorescência em função do pH. Determinaram-se os valores de pK correspondentes às diversas formas de meta-hemoglobina em equilíbrio para a proteína íntegra (pK1 = 7,7 e pK2 = 9,5), trímero (pK2 = 9,2) e monômero (pK2 = 9,7), bem como para a proteína íntegra (pK2 = 10,6) e monômero (pK2 = 12,3) na forma ciano-meta. A existência de dois valores de pK na fração íntegra foi explicada por um equilíbrio em função do pH da meta-hemoglobina: aquo-meta Hb → hemicromo I ↔ hemicromo II, sendo a primeira transição irreversível e a segunda reversível. O mecanismo proposto para as subunidades trímero e monômero é idêntico, ou seja, hemicromo I ↔ hemicromo II. Acredita-se que estas duas formas já se encontram na forma de hemicromo devido à sua obtenção em pH alcalino (9,0). Mesmo com a reacidulação da solução (pH 7,0) não se obtém a forma aquo-meta. Os valores de pK para a forma ciano-meta, tanto para a proteína íntegra como para o monômero, são bem maiores quando comparados à meta-hemoglobina, o que é consistente com a dificuldade de remoção do ligante cianeto. No estudo da emissão de fluorescência destas frações, observou-se o rendimento quântico de fluorescência (RQ), espalhamento de luz, λmáx de emissão e absorbância em 415 nm (Soret). Todas estas frações aumentam de RQ com o aumento do pH em proporções diferentes, sendo isto devido à maior exposição dos resíduos de triptofano contidos na molécula de proteína com o aumento do pH. Os valores de RQ são maiores nas frações trímero e monômero em comparação com a proteína íntegra, por já terem sido submetidas a pH 9,0 no processo de obtenção, bem como por não conterem a supressão de fluorescência intrasubunidades que ocorre na proteína íntegra. A obtenção da globina a partir da hemoglobina de Glossoscolex paulistus também foi estudada, notando-se a presença das frações trímero e monômero. Estas frações foram analisadas por fluorescência e observou-se que os valores de seu RQ são muito altos quando comparados às formas trímero e monômero da oxi-hemoglobina de Glossoscolex paulistus. Este aumento é devido à ausência do heme na molécula de globina, o que anula a transferência de energia dos resíduos de triptofano para o heme, causando um RQ muito baixo na hemoglobina nativa. Um estudo de fluorescência da fração monomérica da globina em função do pH foi também realizado, e nota-se que, tanto em pHs alcalinos como ácidos, o valor de RQ diminui, sendo o seu valor máximo em torno de pH 7,0. A reconstituição da fração monomérica da globina com algumas porfirinas também foi estudada por fluorescência e observou-se que o valor da fluorescência decresce com o aumento da quantidade de porfirina adicionada, devido à supressão de fluorescência causada pela transferência de energia dos resíduos de triptofano para o heme. As constantes de Stern-Volmer também foram determinadas e são da ordem de Ksv = 1,5 × 105 M-1 (TMPyP), Ksv = 4,4 × 105 M-1 (FeTMPyP), Ksv = 4,6 × 105 M-1 (TPPS4) e Ksv = 2,0 × 105 M-1 (hemina), evidenciando uma maior associação da hemina com a globina em comparação com as porfirinas modelo carregadas e solúveis em água.