Estudos proteômicos da transição epitélio-mensenquimal induzida por TGF-β e EGF em linhagens celulares de câncer de pâncreas

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Canchaya, Gabriela Norma Solano
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Análise proteômica; Cancer epithelial cells; Células epiteliais de câncer de pâncreas; Epithelial-Mesenchymal transition; Fatores de crescimento; Growth factors; Proteomic analysis; SILAC; Transição epitelial-mesenquimal
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-05012017-095632/

O câncer de pâncreas é considerado um dos adenocarcinomas mais agressivos, ocupando o quarto lugar de mortes devidas a câncer, isto é dado principalmente a seu desenvolvimento silencioso e a sua complexidade genética, tornando-o de difícil detecção. Consequentemente, o diagnóstico desta doença ocorre apenas em fase tardia, quando o tratamento é apenas para fins paliativos. As anomalias genéticas mais frequentes no câncer de pâncreas invasivo estão relacionadas à ativação por mutações do gene KRAS e à inativação dos genes supressores de tumor CDKN2A, TP53, SMAD4 e BRCA2. Além destas conhecidas vias de sinalização, fatores de crescimento como o TGF-? e EGF também apresentam papel fundamental na progressão e metástase do câncer de pâncreas. Interessantemente, TGF-? e EGF são também indutores do processo denominado transição epitelial-mesenquimal (EMT), onde células epiteliais normais, durante a embriogênese, ou células cancerosas durante a progressão tumoral e metástase, perdem seus contatos intracelulares e adquirem caráter migratório. Desta forma a EMT, induzida por altos níveis de TGF-? e/ou EGF, é considerada como um dos mecanismos de progressão tumoral em adenocarcinomas. No presente estudo, foram estudados os proteomas e o fosfoproteoma da EMT do PanCa. Assim, células de câncer de pâncreas PANC- 1 foram induzidas à EMT em cultura com os fatores de crescimento TGF-?1 ou TGF-?2 e EGF, e após a indução, marcadores moleculares e propriedades funcionais de migração e invasão foram confirmados. Duas condições de indução da EMT foram estabelecidas, para as quais foram desenvolvidas as análises proteômicas quantitativas. A abordagem foi baseada em marcação isotópica de células em cultura (SILAC), em conjunto com fracionamento celular e de proteínas intactas, e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para identificação de proteínas em larga escala. No total, aproximadamente 5.000 proteínas foram identificadas, e a maioria delas quantificadas com precisão nas duplicatas experimentais. Foram selecionadas 37 proteínas com expressão diferencial estatisticamente significativa nos experimentos proteômicos, as quais participam principalmente em processos de biogênese, adesão e apoptóticos. A análise de redes de interação revelou que as proteínas alteradas estavam principalmente localizadas em vias de sinalização que controlam processos de organização da matriz extracelular, splicing alternativo e regulação da apoptose. A análise do fosfoproteoma foi feita usando TGF-?1 como agente indutor da EMT nas células PANC-1, usando a estratégia ERLIC para o enriquecimento de fosfopeptídeos. No total, foram identificados 5.965 fosfopeptídeos não redundantes, correspondendo a um total de 2.250 fosfoproteínas analisadas, sendo quantificadas 2.053 ao menos em duas replicatas, e destas foram identificados 61 fosfopeptídeos regulados pertencentes a 55 fosfoproteínas, relacionados com processos de regulação do mRNA e vias de sinalização ligadas à adesão celular. Em conclusão, nosso estudo elucida potenciais novos alvos para inibição da EMT, controle da metástase, ou para auxiliar no diagnóstico da doença, quando devidamente validada.