Novo método de fracionamento da peçonha do escorpião Tityus serrulatus e caracterização eletrofisiológica das toxinas Ts6 e Ts7

• Ano de defesa: 2012
• Autor(a) principal: Cerni, Felipe Augusto
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: ?-KTx; a-KTx; canais para potássio; electrophysiology; eletrofisiologia; fracionamento de toxinas; fractionation of toxins; neurotoxinas; neurotoxins; potassium channels; Tityus serrulatus; Ts6; Ts7
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-26092012-150049/

No Brasil, a espécie Tityus serrulatus (Ts) é a responsável pela maioria dos acidentes de envenenamento com escorpiões, bem como pela maior incidência de acidentes ocasionados por animais peçonhentos. Isso ocorre devido ao fato desta espécie possuir somente fêmeas, realizando uma reprodução assexuada (partenogênese), facilitando assim sua proliferação. Atualmente, existem 16 diferentes toxinas descritas provenientes da peçonha de Ts, sendo a Ts1 a mais abundante na peçonha solúvel. Dentre estas toxinas, as neurotoxinas com ação em canais para sódio e potássio são as que despertam maior interesse da comunidade científica, devido aos seus efeitos no envenenamento e especificidades por canais iônicos. As neurotoxinas com ação em canais para potássio são compostas por uma alfa-hélice e três fitas-beta antiparalelas, e são constituídas por 23-43 resíduos de aminoácidos. Essas estão classificadas em quatro famílias (?-, ?-, g- e k-KTx). A família ?-KTx é a de maior relevância e está dividida em 21 subfamílias. Estas toxinas com alta especificidade para diferentes subtipos de canais para sódio e potássio são de extrema importância, pois podem ser utilizadas como ferramentas terapêuticas específicas para células-alvo. Até o momento, nosso grupo realizava o isolamento dessas toxinas utilizando como primeira etapa de purificação a cromatografia da peçonha em coluna de CM-Celulose-52, segundo protocolo descrito por Arantes e colaboradores (1989). O presente trabalho padronizou um novo método de fracionamento inicial da peçonha utilizando a mesma coluna, porém incorporando o uso de CLAE (Cromatografia Liquida de Alta Eficiência), onde foi possível observar um perfil cromatográfico semelhante ao anterior (XIII Frações), porém com maior reprodutibilidade e praticidade. Algumas frações do método anteriormente descrito foram subdivididas em duas (VIA-VIB, VIIIA-VIIIB, IXA-IXB e XIA-XIB), demonstrando que o novo procedimento também apresenta melhor resolução dos componentes da peçonha. Utilizando o novo método, foram purificadas as toxinas Ts6 e Ts7. Os efeitos dessas toxinas foram avaliados em 14 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv3.1, Kv4.3, Kv7.1, Kv7.2, Kv7.4, hERG e Shaker), expressos em células de oócitos de Xenopus laevis, através da técnica de voltage-clamp com dois microeletrodos. A toxina Ts6 (1?M) demonstrou ter ação em 11 tipos de canais (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, Kv4.3, Kv7.1, Kv7.2, Kv7.4, hERG e Shaker), porém nos canais Kv1.2, Kv1.3 e Shaker sua ação bloqueadora foi mais intensa. Através de experimentos de dose-resposta foi possível comprovar tal seletividade, demonstrando que a toxina Ts6 atua em quantidades extremamente baixas em ambos os canais (IC50 Kv1.2 = 6,19 ± 0,35 nM /IC50 Kv1.3 = 0,55 ± 0,20 nM). A toxina Ts7 (1?M) demonstrou ter ação em 11 tipos de canais para K+ (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4 Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv3.1, Kv7.1, hERG e Shaker), porém a ação de bloqueio em vários subtipos de canais não apresentou diferenças significativas, mostrando baixa seletividade entre os canais analisados. Este trabalho foi de Resumo ii extrema importância por melhorar a reprodutibilidade, praticidade e resolução do método de fracionamento da peçonha de Ts, bem como por fornecer uma avaliação eletrofisiológica criteriosa das toxinas Ts6 e Ts7 em diferentes subtipos de canais para potássio. O presente estudo demonstra a potencial aplicação da toxina Ts6, seletiva para canais Kv 1.3, para o tratamento de doenças autoimunes. Além disso, indica o uso das toxinas Ts6 e Ts7 como ferramentas para o estudo de características estruturais e funcionais de canais para potássio.