Validação e avaliação dos efeitos das mutações em KMT2D, CREBBP, NOTCH2, ATM, TSC2 e GNAS nos leiomiossarcomas uterinos

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Anjos, Laura Gonzalez dos
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Biomarcador tumoral; Expressão genética; Gene expression; Leiomiossarcoma; Leiomyosarcoma; Methylation; Metilação; Mutação pontual; Neoplasias uterinas; Point mutation; Sequenciamento; Sequencing; Tumor biomarker; Uterine neoplasms
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5139/tde-02082024-150551/

O leiomiossarcoma uterino (LMSU) apresenta-se como um desafio diagnóstico e terapêutico devido tanto a seus aspectos histomorfológicos quanto à sua natureza rara e complexa. Desse modo, apesar dos avanços obtidos no estudo desses tumores, ainda enfrentamos sérias limitações na compreensão de sua biologia molecular específica. Em pesquisa anterior, foram identificadas mutações genéticas relevantes em amostras de LMSU que sugeriam uma possível associação entre elas e a patogênese desses tumores. No presente trabalho, buscamos nos aprofundar nessa investigação, focando no perfil de expressão de genes específicos (KMT2D, CREBBP, NOTCH2, ATM, TSC2 e GNAS), na validação das mutações identificadas, no perfil de metilação desses genes e em sua associação com as características clínicas e anatomopatológicas dos tumores. Para isso, foram coletadas 30 amostras, incluindo em 15 LMSU FFPE e 15 congeladas. As congeladas incluíram 3 LMSU, 3 leiomiomas uterinos (LMU), 3 miométrios (MM) e 6 outros tipos histológicos de sarcoma uterino (SUs). Simultaneamente, foram utilizadas duas linhagens celulares, LMU (THESCs CRL - 4003) e LMSU (SK-UT-1 - HTB-114), a fim de futuras validações funcionais que nos garantirá uma análise mais abrangente. O DNA genômico das amostras FFPE foram utilizados na avaliação dos níveis de metilação por meio do sistema Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip 850k. Já o RNA das amostras congeladas foi submetido à análise de expressão gênica por PCR em tempo real (qRT-PCR), utilizando sondas TaqMan®. As mutações em CREBBP, NOTCH2, GNAS foram validadas por sequenciamento de Sanger, seguindo o protocolo do Big Dye. Os resultados mostraram perdas significativas na expressão dos genes CREBBP, GNAS e NOTCH2 nos LMSU, conforme evidenciado pela análise de qRT-PCR. O sequenciamento revelou padrões genéticos distintos, incluindo mutações específicas, como c.4063G>A em CREBBP e uma substituição T>A na posição 78 em NOTCH2. Foi observada também redução acentuada no padrão de metilação em regiões CpG, indicando perfis de alteração epigenética distintos nos LMSU. Associando a metilação aos resultados clínicos, o ATM foi identificado como um potencial biomarcador prognóstico independente. Análises in silico destacaram genes cruciais na regulação transcricional positiva e controle da via Notch, como EP300, STAT1, DLL1 e MAML2. Em conclusão, nosso estudo integra análises complexas de expressão gênica, sequenciamento, metilação e dados clínicos, proporcionando uma visão ampla da complexidade molecular dos LMSU. Os resultados obtidos, não apenas expandem nosso entendimento da biologia desses tumores, mas também contribuem para o progresso em seu manejo clínico, além de abrir novas possibilidades de estudo dessas neoplasias