Estudos sobre o módulo toxina-antitoxina VapBC 1 de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Damiano, Deborah Kohn
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Leptospira; Lon; Toxin-Antitoxin; Toxina-Antitoxina; VapBC
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-09052024-224145/

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial e a linhagem L. interrogans sorovar Copenhageni é a responsável pelo maior número de casos humanos de leptospirose no Brasil. Seu genoma foi sequenciado, contribuindo para o entendimento dos mecanismos moleculares da doença. Recentemente os sistemas Toxina-Antitoxina (TA) vêm se destacando por terem sido relacionados à fisiologia bacteriana durante a infecção. Os sistemas TA codificam uma antitoxina e uma toxina e em situações normais a toxina é bloqueada pela antitoxina. Havendo um desequilíbrio nas condições ambientais, há diminuição da concentração de antitoxina devido à degradação por proteases como a Lon, resultando em exposição da célula para os efeitos tóxicos, podendo levar à interrupção do crescimento, formação de células persistentes ou até morte celular. Os sistemas TA são divididos em famílias, sendo a VapBC a principal família TA de tipo II, classificada com base na presença de um domínio PIN (PilT N-terminal). Segundo a pesquisa no banco de dados TADB, existem quatro loci vapBC identificados na estirpe L. interrogans sorovar Copenhageni Fiocruz L1-130. Nosso grupo já realizou a caracterização bioquímica e funcional do módulo VapBC-3, e atualmente estuda os módulos VapBC-1, 2 e 4. Os objetivos deste projeto incluem a clonagem, expressão e caracterização bioquímica e funcional do módulo VapBC-1 e, secundariamente estudos da atividade da enzima Lon sobre a antitoxina VapB, para o desenvolvimento de uma metodologia de obtenção das toxinas ativas através da expressão do complexo VapB-VapC. Os genes de interesse vapB-1, vapC-1, lon e o complexo vapBC-1 foram clonados e expressos em E. coli BL21(DE3). A proteína VapB-1 foi purificada por IMAC a partir da fração solúvel, apresentando um rendimento final de 1,625 mg. A proteína VapC-1 foi sintetizada majoritariamente na fração insolúvel, mas se mostrou de difícil obtenção. A obtenção da VapC-1 a partir de uma fração precipitada extraída do gel de poliacrilamida apresentou rendimento final de 480 µg, e poderá ser utilizada para imunizações. A purificação do complexo VapBC-1 demonstrou a afinidade esperada entre a antitoxina VapB-1 e a toxina VapC-1 e a maior susceptibilidade da antitoxina VapB-1 à ação enzimática foi demonstrada através do ensaio de digestão por tripsina. Devido àsdificuldades de obtenção da protease Lon esta parte do trabalho foi interrompida. A atividade das proteínas VapB-1, VapC-1 e do complexo VapBC-1 sobre células de E. coli foi testada, porém não foi possível observar o efeito tóxico da toxina VapC-1 em meio líquido, indicando que este módulo não seja funcional ou não se comporte como grande parte dos sistemas TA descritos na literatura. No entanto, estudos preliminares de viabilidade celular em meio sólido demonstraram tendência da proteína VapC-1 reduzir a viabilidade celular em 2 horas após a indução. O avanço na compreensão dos sistemas TA é importante para a compreensão dos mecanismos envolvidos na infecção por Leptospira.