Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP.
Ano de defesa: | 2003 |
---|---|
Autor(a) principal: | |
Orientador(a): | |
Banca de defesa: | |
Tipo de documento: | Tese |
Tipo de acesso: | Acesso aberto |
Idioma: | por |
Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
|
Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
|
Departamento: |
Não Informado pela instituição
|
País: |
Não Informado pela instituição
|
Palavras-chave em Português: | |
Link de acesso: | http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-24062008-163341/ |
Resumo: | O presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 Å de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente. |
id |
USP_7741272db4db32c01bf3ecf29510c068 |
---|---|
oai_identifier_str |
oai:teses.usp.br:tde-24062008-163341 |
network_acronym_str |
USP |
network_name_str |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
repository_id_str |
|
spelling |
Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP.Crystal structure of Leishmania tarentolae hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) with bound GMP.CaracterizaçãoCharacterizationCrystal structureEstrutura cristalográficaHipoxantina-guanina fosforribosiltransferaseHypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferaseLeishmania tarentolaeLeishmania tarentolaeleishmanioseLeishmanioseO presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 Å de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente.The aims of this work were the cloning, expression and purification of the protein HGPRT from Leishimania tarentolae, for the characterization and crystallization of the enzyme for it structural and functional study. The full-length hgprt gene was isolated from a leishmania tarentolae UC strain Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I genomic library. This gene was cloned in the expression vector pET29a+, and used in the transformation of the bacteria Escherichia coli BL21(DE3). This expression system presented a super-expression of the recombinant protein, which was purified by ionic change chromatography, utilizing the anionic change column POROS 20HQ. The purified protein was utilized for its characterization, including its kinetics constants (Km, Vmax e Kcat) for different substrates. The protein was found to be a dimmer in solution with pI close to 8.2. Besides, this protein was used in the crystallization assays by the steam diffusion in suspended drop technique. The obtained crystals were utilized in the x-ray diffraction studies. The data collection was performed in the Laboratório Nacional de Luz Síncroton. The X-ray diffraction data were processed utilizing the package program HKL. The crystallographic structure resolution was obtained by the molecular replacement method from the AmoRe program. For the structure refinement, the automatic refinement programs CNS and REFMAC were used, and the graphic manipulation was made through the O program. The structure of the HGPRT was resolved with 2,1 Å of resolution and final agreement factors Rwork and Rfree of 17,34% and 21,53%, respectively.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPOliva, GlauciusMonzani, Paulo Sérgio2003-03-20info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttp://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-24062008-163341/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2016-07-28T16:09:56Zoai:teses.usp.br:tde-24062008-163341Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212016-07-28T16:09:56Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false |
dc.title.none.fl_str_mv |
Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. Crystal structure of Leishmania tarentolae hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) with bound GMP. |
title |
Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. |
spellingShingle |
Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. Monzani, Paulo Sérgio Caracterização Characterization Crystal structure Estrutura cristalográfica Hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Leishmania tarentolae Leishmania tarentolae leishmaniose Leishmaniose |
title_short |
Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. |
title_full |
Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. |
title_fullStr |
Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. |
title_full_unstemmed |
Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. |
title_sort |
Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. |
author |
Monzani, Paulo Sérgio |
author_facet |
Monzani, Paulo Sérgio |
author_role |
author |
dc.contributor.none.fl_str_mv |
Oliva, Glaucius |
dc.contributor.author.fl_str_mv |
Monzani, Paulo Sérgio |
dc.subject.por.fl_str_mv |
Caracterização Characterization Crystal structure Estrutura cristalográfica Hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Leishmania tarentolae Leishmania tarentolae leishmaniose Leishmaniose |
topic |
Caracterização Characterization Crystal structure Estrutura cristalográfica Hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Leishmania tarentolae Leishmania tarentolae leishmaniose Leishmaniose |
description |
O presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 Å de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente. |
publishDate |
2003 |
dc.date.none.fl_str_mv |
2003-03-20 |
dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
format |
doctoralThesis |
status_str |
publishedVersion |
dc.identifier.uri.fl_str_mv |
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-24062008-163341/ |
url |
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-24062008-163341/ |
dc.language.iso.fl_str_mv |
por |
language |
por |
dc.relation.none.fl_str_mv |
|
dc.rights.driver.fl_str_mv |
Liberar o conteúdo para acesso público. info:eu-repo/semantics/openAccess |
rights_invalid_str_mv |
Liberar o conteúdo para acesso público. |
eu_rights_str_mv |
openAccess |
dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf |
dc.coverage.none.fl_str_mv |
|
dc.publisher.none.fl_str_mv |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
publisher.none.fl_str_mv |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP instname:Universidade de São Paulo (USP) instacron:USP |
instname_str |
Universidade de São Paulo (USP) |
instacron_str |
USP |
institution |
USP |
reponame_str |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
collection |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
repository.name.fl_str_mv |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP) |
repository.mail.fl_str_mv |
virginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.br |
_version_ |
1815258418010652672 |