Produção in vitro de embriões bovinos em diferentes sistemas de cultivo 3D: efeitos na morfologia nuclear, padrão de metilação, transcrição gênica e vesículas extracelulares

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Ferronato, Giuliana de Ávila
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: In vitro embryos production; Alginate hydrogel; Bovine; Bovino; Hidrogel de alginato; Liquid marbles; Produção in vitro de embriões
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/74/74135/tde-03072023-110254/

A produção in vitro de embriões (PIV) é uma técnica amplamente utilizada para melhorar os parâmetros reprodutivos em bovinos e humanos. No entanto, a PIV ainda apresenta algumas limitações, como menores taxas de blastocisto e prenhez em comparação com embriões produzidos in vivo. Além disso, os embriões obtidos através da PIV possuem alterações epigenéticas que podem afetar o estabelecimento da prenhez e da saúde pós-natal. In vitro, os embriões são cultivados em placas, que podem ser seis vezes mais rígidas do que o ambiente in vivo, o que causa diferentes estímulos externos que geram diferentes respostas biológicas intracelulares nesses embriões. Uma alternativa bem estabelecida por ser mais fisiológica são os cultivos tridimensionais (3D), que consistem na criação de um microambiente onde as células interagem melhor entre si e com o meio de cultivo. Esses cultivos podem ser produzidos de diferentes formas e materiais. As liquid marbles (LM), são um tipo de cultivo 3D que consiste na criação de um ambiente através de uma pequena gota de líquido encapsulada por partículas de uma sustância hidrofóbica. Outro material constantemente utilizado é o alginato, que possui a capacidade de gerar um hidrogel estável a partir da adição de um íon bivalente. Baseado nisso, a nossa hipótese é que os sistemas 3D por LM ou hidrogéis de alginato possam contribuir positivamente durante as etapas de maturação e cultivo dos embriões produzidos in vitro. Para isso, no experimento 1 (capítulo 2), a maturação in vitro (MIV) foi realizada no sistema de LM e quando avaliada a taxa de maturação nuclear observamos que foi semelhante à do cultivo convencional. Contudo, a expansão das células do cumulus e a expressão de genes importantes para o processo de maturação dos oócitos nas células do cumulus foram diminuídos no grupo LM. O cultivo de prováveis zigotos também foi realizado no sistema LM. No dia 7, foi observada uma menor taxa de blastocisto, diminuição na expressão do bta-miR-615 e aumento na metilação e hidroximetilação global de DNA nos blastocistos do grupo LM. No experimento 2 (capítulo 3), o sistema de cultivo 3D por hidrogéis de alginato foi utilizado no cultivo de prováveis zigotos. Neste experimento, o cultivo convencional foi denominado 2D; uma superfície de hidrogel de alginato foi o grupo 2.5D; e o grupo 3D foi aquele em que os embriões foram encapsulados nos hidrogéis de alginato. No dia 7 do cultivo, foi observado uma diminuição na taxa de blastocisto em ambos os grupos 2.5D e 3D em comparação ao controle. Também houve uma diminuição da expressão dos miRNAs miR-1245 e miR-1260b no grupo 2.5D em relação aos demais. Além disso, o miR-541 foi menos expresso nos blastocistos do grupo 3D em relação ao 2D e 2.5D. Os padrões de metilação e hidroximetilação foram aumentados apenas nos embriões do grupo 2.5D. Além disso, também foi observado uma mudança no perfil transcricional global dos blastocistos cultivados em 2.5D e 3D quando comparados com o grupo 2D, em que genes importantes para o desenvolvimento embrionário inicial foram diferentemente expressos entre os embriões dos diferentes grupos. Juntos, estes resultados sugerem que os cultivos 3D utilizados nos nossos experimentos tiveram um impacto negativo na taxa de produção de embriões bovinos. Entretanto, mais estudos são necessários, visto que, para obtenção dos resultados de embriões produzidos in vitro que temos atualmente foram necessários mais de 40 anos de estudo e essa técnica continua sendo constantemente aprimorada. Portanto, em pesquisas futuras precisamos considerar a hipótese de que com a utilização do cultivo 3D será possível obter blastocistos de PIV semelhantes aos produzidos in vivo.