Seleção de aptâmeros que se ligam ao receptor humano para o gosto doce

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Almeida, Tiago Jonas de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Ácidos nucléicos; Aptâmeros; Aptamers; CD36; HT1R2/hT1R3; Nucleic acids; Receptor para o gosto doce; SELEX; Sweet taste receptor
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-23012015-094608/

Foi demonstrado que o gosto doce é transduzido por receptores acoplados a proteína G classe III (GPCRs), T1R2 e T1R3. Essas proteínas exibem longas extremidades amino-terminais que formam um domínio de ligação globular extracelular. Elas são expressas em células associadas ao gosto (células epiteliais que constituem os botões gustativos nas papilas gustativas), que respondem a moléculas associadas ao gosto doce. Quando T1R2 e T1R3 são co-expressas em células heterólogas, elas respondem, como heterômeros, a uma série de açúcares, alguns D-aminoácidos, edulcorantes artificiais e proteínas doces. Foi também demonstrado que o receptor humano T1R2/T1R3 para o gosto doce apresenta múltiplos sítios de ligação. Para melhor compreender a estrutura desse receptor e responder à pergunta de como um único quimiorreceptor pode ser responsivo a uma variedade de ligantes, foi utilizada a abordagem denominada evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) para isolar, a partir de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos, aptâmeros de RNA resistentes a nuclease que se ligam ao receptor humano para o gosto doce com alta afinidade. Após um enriquecimento de doze ciclos do pool original de RNA contendo em torno de 1013 sequências diferentes (contra preparações de membrana de células HEK293T que expressam hT1R2/hT1R3) e outros ciclos de contrasseleção negativa (para eliminar moléculas de RNA que se ligam de forma inespecífica à membrana de nitrocelulose e a outras proteínas diferentes do alvo, ou seja, proteínas de membrana de células HEK293T selvagem), realizou-se a transcrição reversa do RNA seguida de amplificação por PCR e sequenciamento. Aptâmeros do ciclo 12 com sequências consenso foram selecionados, e a ligação de alguns deles com hT1R2/hT1R3 foi então avaliada. Cinco desses aptâmeros mostram claramente uma maior afinidade por células HEK293T que expressam hT1R2/hT1R3. Como segunda parte desta tese, estudamos outro receptor, denominado CD36, que, como o receptor T1R2/T1R3, é expresso na língua. Estudos indicam que ele age como receptor gustativo de gordura. Neste trabalho, verificamos que essa proteína é expressa em uma subpopulação de neurônios olfatórios presentes no epitélio olfatório, indicando que ela pode ter também uma função olfatória, ainda não caracterizada.