Produção heteróloga em Escherichia coli BL21 (DE3) ΔasnA/ΔasnB de L-Asparaginase resistente a proteases plasmáticas

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Lopes, Maria Beatriz Nóbrega
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Acute Lymphoblastic Leukemia; Downstream; Escherichia coli; Extracellular L-Asparaginase; L-Asparaginase; L-Asparaginase extracelular; Leucemia Linfoblástica Aguda; Protein purification; Purificação de proteínas
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-20012025-155320/

A L-asparaginase tipo II de Escherichia coli é um agente terapêutico fundamental no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. No entanto, a eficácia e o uso da L-Asparaginase têm sido limitados por frequentes reações de hipersensibilidade e pela formação de anticorpos anti-asparaginase, que neutralizam sua atividade enzimática. Assim, há uma busca pela produção viável de asparaginases alternativas com baixa toxicidade e alta eficácia. Este trabalho tem como objetivo a produção e purificação da enzima L-Asparaginase modificada EcAP40S/S206C, considerando a sua futura aplicação terapêutica. A produção da enzima foi realizada em modo descontínuo-alimentado em biorreator de bancada com 3 L de meio quimicamente definido e suplementado, à temperatura de 37ºC, com foco na expressão extracelular. A enzima foi produzida majoritariamente nas primeiras duas horas pós-indução, sendo posteriormente secretada para o meio extracelular, alcançando atividade enzimática de 62,9 U/mL. A enzima foi purificada até a homogeneidade a partir do sobrenadante do cultivo. Para isso, foi desenvolvido um processo de purificação que utiliza técnicas de filtração tangencial, cromatografia de troca aniônica e de exclusão molecular. A microfiltração teve o fluxo ótimo do permeado e área mínima de processo determinados em 12,3 LMH e 0,12 m2, respectivamente. A diafiltração apresentou diferença significativa para recuperação da enzima com até 3 diavolumes. A pressão de transmembrana ideal para a ultrafiltração foi de 17 psi ou 1,2 bar. A maior capacidade dinâmica de adsorção entre as condições testadas para a cromatografia aniônica foi de 46 U/mLR, obtida com a resina Q Sepharose® XL e fase móvel Tris 20 mM NaCl 25 mM e pH 8. A EcAP40S/S206C foi conjugada com moléculas de polietilenoglicol mPEG-Mal de 20 kDa por reação sítio-específica em seu resíduo de cisteína adicionado por mutação e foi analisada quanto a sua atividade enzimática e estrutura. O processo resultou em uma L-Asparaginase mutante peguilada, com um rendimento final de 6% e atividade específica determinada por método de Nessler de 90,9 ± 4,1 U/mg. O espectro de dicroísmo circular indicou que a enzima manteve a sua estrutura secundária estável após a reação de peguilação, e a análise por espalhamento dinâmico de luz demonstrou a homogeneidade da amostra alcançada com este processo, revelando a presença de menos de 2% de agregados e índice de polidispersão igual a 0,189. Este trabalho contribui para o desenvolvimento de uma L-Asparaginase nacional, com potencial uso no tratamento da leucemia linfoblástica aguda, reduzindo a dependência do mercado externo.