Validação de parceiros moleculares de Cdc42 em linhagens de células tumorais humanas submetidas a estresse genotóxico

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Silva, Luiz Eduardo da
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Cdc42; DNA Damage Response (DDR); Genomic instability; Instabilidade genômica; Interação proteína-proteína; Protein-protein interaction; Resposta a danos ao DNA (DDR); Rho GTPases
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10032020-134305/

A proteína Cell Division Cycle 42 (CDC42), pertencente à família das Rho GTPases, está envolvida em diversos processos biológicos relacionados à reorganização do citoesqueleto, proliferação celular, motilidade, polaridade, citocinese e transporte vesicular. Nos últimos anos, Cdc42 tem sido implicada também em cenários de instabilidade genômica, sendo observada a sua superexpressão em diversas células tumorais, bem como a sua interação com importantes supressores tumorais em diferentes contextos celulares. Além disso, estudos recentes indicam a sua participação no envelhecimento precoce de linhagens celulares hematopoiéticas e a possível atuação sobre novas estruturas celulares, em contraposição ao tradicional papel desempenhado na membrana plasmática. Estudos prévios conduzidos por nosso grupo mostraram que mutantes de células HeLa Cdc42 constitutivamente ativos (Cdc42-G12V) apresentam uma maior sensibilidade à radiação ultravioleta em relação aos mutantes selvagens de Cdc42. Além disso, estudos de interactoma e proteômica indicaram a possível interação de Cdc42 com as proteínas PHB-2, 14-3-3η, PAK-4 e Cdc42EP3/Borg2 em condições de instabilidade genômica. Com o intuito de validar molecularmente tais interações por outros métodos experimentais, foram conduzidos ensaios de pull down, ligação de proximidade (PLA) e colocalização por microscopia confocal de fluorescência para as três primeiras proteínas parceiras nas linhagens HeLa Parental e HeLa Cdc42-G12V, tratadas ou não com radiação ultravioleta. Por fim, como forma de validação funcional, promoveu-se a expressão ectópica da parceira Cdc42EP3/Borg2 em ambas as linhagens com o intuito de avaliar a influência desta proteína em particular sobre a sobrevivência celular após o estresse genotóxico. Os resultados experimentais comprovaram a interação das parceiras PHB-2, 14-3-3η e PAK-4 pela GTPase no seu estado ativo, fornecendo indícios de papéis relevantes em estruturas subcelulares pouco exploradas para Cdc42 em condições de instabilidade genômica. Para a efetora Cdc42EP3/Borg2, os resultados obtidos demonstraram que sua interação com Cdc42 possivelmente tem papel no seu envolvimento na sensibilização das células à radiação UVC (sobrevivência celular). Essas respostas também são dependentes da ativação constitutiva de Cdc42 e sugerem que parceiros downstream à Cdc42EP3/Borg2, a exemplo das proteínas Sept2 e NCK1/2, poderiam agir conjuntamente para as respostas celulares observadas após estresse genotóxico. Assim, a comprovação molecular e funcional das interações aqui descritas certamente contribuirá para o melhor entendimento do papel de Cdc42 no contexto de resposta a danos ao DNA, abrindo novas possibilidades para a modulação farmacológica de vias envolvendo essa proteína.