Papel da proteína rica em cisteína e glicina 3 (CRP3) na interface actina-adesões focais de células musculares lisas aórticas

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Silva, João Carlos Ribeiro da
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Actin cytoskeleton; Adesões focais; Aorta; Citoesqueleto de actina; Focal adhesions; Mecanotransdução celular; Mechanotransduction cellular; Muscle smooth; Músculo liso; Signal transduction; Transdução de sinais
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5131/tde-18012023-115514/

Células musculares lisas estão em equilíbrio mecânico com o microambiente vascular. As adesões focais são os pontos de ajuste em resposta às deformações ativas e passivas da matriz extracelular. Este fenômeno depende de proteínas de adesões focais que percebem, transmitem e respondem a estímulos físicos. Nosso laboratório demonstrou que a proteína CRP3 atua como mecanossensor em células musculares lisas aórticas, regulando a ativação da quinase de adesão focal (FAK) em resposta ao estiramento. Evidências preliminares sugerem que a ausência da CRP3 previne o remodelamento de adesões focais, prejudicando a contratilidade das células musculares lisas. Este fenótipo se assemelha ao observado em células com prejuízo na sinalização de FAK-Src, enquanto as evidências da literatura apontam também para um papel regulador do CRP3 sobre o citoesqueleto de actina. Logo, postulamos que a CRP3 é crítica para a mecanotransdução de células musculares lisas atuando como ponte molecular entre as adesões focais e o citoesqueleto de actina. Ao estimular células musculares lisas aórticas com angiotensina II (Ang II), verificamos que a ausência de CRP3 prejudica a ativação do eixo FAK-paxilina- p130CAS, via de sinalização fundamental à mecanotransdução. A fim de caracterizar as consequências desta deficiência, analisamos a dinâmica do citoesqueleto de actina, a fosforilação da cadeia regulatória da miosina (MLC) e a quimiotaxia dependente de PDGF-BB. A razão F/G-actina, a fosforilação inibitória de cofilina e os níveis de YAP foram comparáveis em células selvagens (WT) versus CRP3-/- em condições basais e em resposta à angiotensina II. Em concordância, os marcadores de músculo liso dependentes de actina (-SMA, calponina, MYH11 e smoothelina) assim como os níveis de fosforilação de MLC e a contração em resposta ao KCl não se modificaram entre os genótipos, sugerindo que a ausência de CRP3 não afeta o citoesqueleto de actina. A quimiotaxia dependente de PDGF-BB foi menor em células CRP3-/-, consistente com uma deficiência na sinalização de FAK. Esta deficiência se mostrou desacoplada de alterações na viabilidade celular, já que células selvagens e CRP3-/- apresentam progressão similar do ciclo celular. A fim de confirmar a dependência dos eventos de sinalização dependentes de FAK, realizamos ensaios de contração em gel de colágeno e de rigidez por citometria magnético- óptica de oscilação (OMTC) na presença de inibidor de FAK (iFAK). Enquanto a contração de células WT foi negativamente impactada por iFAK, não observamos nenhum efeito nas células CRP3-/-. Já o ensaio de OMTC demonstrou que a rigidez celular é independente da ativação de FAK. A análise da estrutura de CRP3 evidenciou a presença de dois resíduos de tirosina passíveis de fosforilação por FAK (Y57 e Y167), responsivos à Ang II em células cardíacas, podendo então explicar a dependência de CRP3 para a ativação de FAK e promoção da contração. Os dados apresentados revelam que a CRP3 é necessária à ativação do eixo FAK-paxilina-p130CAS, sinalização necessária e suficiente à migração e contratilidade. Na ausência de CRP3, há comprometimento das cascatas de sinalização à jusante, comprometendo a percepção do ambiente e a mecanossinalização, componentes-chave da mecanotransdução vascular. Em conjunto, apresentamos evidências de que a CRP3 influencia a mecanotransdução em células musculares lisas aórticas atuando como ponte entre a actina e as adesões focais