Caracterização de uma enzima quimérica bifuncional celobiohidrolase: β-glicosidase de Aspergillus fumigatus para aproveitamento de resíduos agroindustriais

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Michelassi, Felipe
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: β-glucosidase; &beya;-glicosidase; Biocombustíveis; Biofuels; Caracterização enzimática; Cellobiohydrolase; Celobiohidrolase; Chimeric enzyme; Enzima quimérica; Enzymatic characterization; Enzymatic hydrolysis; Hidrólise enzimática
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-20102025-170017/

Os biocombustíveis despontam como uma alternativa renovável aos combustíveis fósseis, contribuindo para a mitigação das emissões de gases de efeito estufa e para a redução da dependência de recursos não renováveis. Entre as matérias-primas disponíveis, a biomassa lignocelulósica destaca-se como uma fonte promissora para a produção de produtos de alto valor agregado como o etanol de segunda geração. No entanto, sua conversão eficiente ainda constitui um desafio tecnológico relevante. Nesse contexto, as celulases exercem papel fundamental ao degradar a estrutura complexa da lignocelulose, liberando açúcares fermentáveis e a otimização do desempenho dessas enzimas, visando a diminuição nos custos do processo, o que é crucial para o avanço da bioeconomia. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de uma enzima quimérica bifuncional, AfCel6A::AfBgl1.3, obtida por meio da fusão entre a celobiohidrolase (AfCel6A, Afu3g01910) e a β-glicosidase (AfBgl1.3, Afu1g14710), ambas oriundas de Aspergillus fumigatus. A construção visou potencializar a atividade catalítica e a termoestabilidade da enzima resultante. A quimera recombinante foi expressa com sucesso em Pichia pastoris X-33 por um período de 6 dias com a adição diária de 1,5% (v/v) de metanol como indutor. A análise por SDS-PAGE revelou uma banda correspondente a aproximadamente 100 kDa, compatível com a massa molecular prevista. A purificação por afinidade, utilizando resina Ni Sepharose 6 Fast Flow, resultou em uma única banda proteica. A estrutura secundária da enzima purificada foi caracterizada por Dicroísmo Circular (CD), revelando a presença de 29-36% de α-hélices e 9,8-10% de folhas β, além de uma temperatura de fusão aparente (Tm) de 49,5°C. Os parâmetros bioquímicos e de atividade foram avaliados a partir do sobrenadante concentrado. A enzima apresentou temperatura ótima em torno de 40°C e faixa de pH ideal entre 5,4 e 6,0. A atividade enzimática foi significativamente modulada por 5 mM de Mn²+, Co²+ e Ag+, com aumentos de até 237%, 176% e 200,5%, respectivamente. Ainda, apresentou alta tolerância a glicose, não sofrendo inibição pelo produto. A avaliação funcional mostrou que a adição de 1,2 µg da quimera ao coquetel enzimático comercial Celluclast® 1.5L promoveu um efeito sinérgico, resultando em um aumento de até 59% na liberação de glicose durante a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar explodido após 12 horas de incubação. Esses resultados evidenciam o potencial da quimera AfCel6A::AfBgl1.3 como ferramenta biotecnológica promissora para a otimização da sacarificação de biomassas lignocelulósicas, e estão alinhados aos Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS), em especial ao ODS 12, que propõe assegurar padrões sustentáveis de produção e consumo. Com destaque para a meta 12.5 da ODS que visa \"Até 2030, reduzir substancialmente a geração de resíduos por meio da prevenção, redução, reciclagem e reutilização\".