Estudo sobre o mecanismo de transcrição dos genes rif (repetitive interspersed family) no Plasmodium falciparum e o papel da demetilase putativa LSD1, como possível modificador de histonas em&n.

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Araujo, Rosana Beatriz Duque
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Plasmodium falciparum; demethylases; desmetilases; genes rif; P. berghei; rif genes
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42135/tde-12012024-182559/

Todas as espécies de Plasmodium possuem famílias de genes variantes que podem mediar o escape do sistema imune do hospedeiro vertebrado. No Plasmodium falciparum, a família dos genes rif codifica para antígenos variantes que são parcialmente expostos na superfície das hemácias infectadas e podem funcionar como fatores de virulência por meio da interação com os receptores das células hospedeiras. O controle da expressão dos genes rif, no entanto, não é claro e vários estudos relataram resultados contraditórios. Aqui, abordamos o modo de transcrição de rif usando duas abordagens, a primeira foi um vetor plasmídico com dois marcadores de resistência a drogas. Neste vetor, uma região a upstream rif 5\' controlava a expressão de um dos marcadores de resistência, enquanto as linhas de parasitas transfectantes são selecionadas com o segundo marcador, expresso constitutivamente. Ao testar três diferentes regiões upstream rif 5\', descobrimos que uma era impossível de ser ativada, a segunda era constitutivamente expressa, enquanto uma terceira região upstream apresento atividade que variava amplamente com a pressão da droga aplicada na cultura. Essa construção também se integrou ao genoma. Quando a transcrição global de genes rif nesses transfectantes foi comparada na presença ou ausência das drogas de seleção, observamos que a ativação /silenciamento de todos os outros loci rif não mudou profundamente entre as cepas. Na segunda abordagem, foi usado o plasmídeo prifGFPHA2A-BSDglmS. Este plasmídeo possui um marcador de resistência expresso constitutivamente, permitindo a seleção de linhas de parasitas transfectadas. O segundo marcador é então usado para selecionar/promover a expressão dos genes rif alvo. O segundo marcador só é transcrito se ocorrer um knockin no gene alvo, o que levou à criação de um gene híbrido, contendo o gene alvo, gfp-ha e o marcadador de resistência, ambos controlados pelo promotor genômico original do gene rif alvo. Quando ocorreu a recombinação, devido à região de homologia da seqüência rif, os parasitas modificados produziram uma proteína fundida, RIFIN-GFP-HA-2A-BSD. Essa construção também tinha a seqüência glmS, que forma uma ribozima uma vez que o RNA é sintetizado, permitindo truncar condicionalmente o transcrito de rif-gfpha-2a-bsd. Após a integração em um dos locos rif, observamos que, apesar da funcionalidade do construto 2A-BSD-glms, não conseguimos obter RNA suficiente para realizar qualquer ensaio funcional. Provavelmente, o promotor rif alvo produziu pouco transcrito para produzir blasticidina desaminase suficiente e manter os níveis adequados de parasitemia. Em esta parte do trabalho, concluímos que ou não há crosstalk entre os loci rif ou que, diferente aos promotores var, apenas a região 5\' upstream a dos genes rif não é capaz de promover o mecanismo de transcrição por exclusão alélica nos genes rif. Também é possível que a subfamília B dos genes rif seja regulada de uma maneira diferente em comparação com a subfamília rif A. Entre os fatores que podem afetar a transcrição de genes variantes em P. falciparum estão a metilação do DNA, modificações de cromatina, proteínas de ligação à cromatina e talvez RNAs não codificantes. P. falciparum possui duas famílias desmetilases de lisina de histona que empregam dois mecanismos moleculares diferentes de desmetilação, e no seu genoma contém pelo menos uma LSD1. A proteína PfLSD1 desmetila especificamente histona 3 mono ou dimetilada na lisina 4 ou 9. Neste trabalho, exploramos a função da LSD1 putativa do P. falciparum na dinâmica de transcrição de genes variantes e outras famílias de genes, bem como sua interação com outras proteínas. Foi gerada a linhagem de parasitas transgênicos PfLSD1GFPHAglmS. A eficiência do knockdown ao nível transcricional foi avaliada via RT-qPCR e ao nível proteico por ensaios de Western blot. Foi realizada uma análise de espectrometria de massa (MS) após o pull-down da PfLSD1 marcada com HA para explorar as interações proteicas, e para explorar a resposta transcricional ao nível global do parasita quando o PfLSD1 era abolida, foi feita uma análise de seqüenciamento por RNA-Seq. Observamos que o knockdown de PfLSD1 leva a uma diminuição significativa do nível de transcrição do Pflsd1, no entanto, não afetou a viabilidade do parasita pelo menos durante o estágio eritrocitário. O resultado do ensaio de MS sugeriu uma interação entre a PfLSD1 e a histona H3 e outras proteínas de remodelação da cromatina no estágio de trofozoíto. Na análise por RT-qPCR e RNA-Seq, não foi possível observar nenhuma alteração significativa no perfil transcricional dos genes variantes. Em vez disso, os genes que mostram alteração mais significativa foram os genes relacionados ao metabolismo do DNA e desenvolvimento sexual. Nossos resultados sugerem que a PfLSD1 não participa da dinâmica transcricional da variação antigênica. No entanto, no knockout do roedor P. berghei LSD1 a linhagem de parasitas P.berghei PbOokluc-LSD1KO mostrou uma formação atrasada ou incompleta de formas de oocineto. De acordo com os dados do transcriptoma de estudos, sugerimos que as proteínas LSD1 dos parasitas Plasmodium podem participar da regulação epigenética dos estágios sexuais dos parasitas, possivelmente das formas oocineto.