Caracterização bioquímica e imunológica de proteínas hipotéticas de superfície de Leptospira interrogans

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Passalia, Felipe José
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Leptospira; Leptospirose; Leptospirosis; Pathogenesis; Patogênese; Proteína recombinante; Recombinant protein; Vaccine; Vacina
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-13052024-110713/

A leptospirose é uma zoonose de importância global considerada uma das principais doenças infecciosas emergentes. Nos centros urbanos, os roedores são os principais reservatórios da doença, devido as leptospiras colonizam seus rins e serem excretadas vivas no ambiente através da urina. Os seres humanos e animais são infectados principalmente através do contato com água ou solo contaminados. Em decorrência do amplo espectro de sintomas que o paciente pode apresentar, aliado a ausência de diagnóstico clínico da doença, o número de casos no mundo permanece subestimado, sem a existência de uma vacina eficaz até o momento. A identificação de proteínas possivelmente localizadas na membrana externa e conservadas entre estirpes patogênicas é uma das principais abordagens de pesquisa para elucidar os mecanismos de patogenicidade. O presente projeto tem como objetivo a clonagem, expressão e purificação de novas proteínas preditas de membrana, avaliação da capacidade de interação com componentes da matriz extracelular e componentes do plasma de hospedeiros, além da avaliação do potencial diagnóstico e de imunoproteção em modelo animais. Os genes lic13086 e lic10774 foram analisados por bioinformática e codificam proteínas possivelmente expostas na superfície com domínios sem função conhecida e, dessa forma, foram selecionados para o projeto. Os genes foram clonados, a expressão das proteínas recombinantes foi feita em Escherichia coli e a purificação realizada por cromatografia de afinidade ao metal. As proteínas não foram detectadas em soros de humanos diagnosticados laboratorialmente com leptospirose, assim não são bons candidatos a não marcadores para diagnóstico. Por ensaios de ELISA, citometria de fluxo e imunofluorescência, foi demonstrado que as proteínas LIC13086 e LIC10774 estão localizadas na superfície externa da L. interrogans. Ambas as proteínas se ligaram à laminina, presente na matriz extracelular do hospedeiro, e também aos componentes plasminogênio, fibronectina plasmática, fibrinogênio, C4BP, trombina, C4b, C5b6, C7, C8 e C9, presentes no plasma. A rLIC10774 é capaz de se ligar ao cálcio, conferindo mudanças conformacionais, térmicas e de ligação aos componentes do hospedeiro, além de ser capaz de afetar a coagulação quando suplementada com cálcio. Em ensaios analisando a ligação direta a diversas linhagens celulares, as proteínas recombinantes não apresentaram interação, sugerindo que não se ligam a receptores celulares durante o processo infeccioso. As proteínas recombinantes como vacina de subunidade não exerceram proteção no modelo de leptospirose em hamsters após desafio letal. Para avaliar o ganho de função, foram construídas L. biflexa recombinantes expressando as proteínas LIC13086 ou LIC10774, porém não foi possível obter a expressão heteróloga das proteínas na espécie saprofítica, apesar de observados altos níveis transcritos. O mutante knock-out do gene lic13086 obtido por troca alélica em L. interrogans não apresentou diferença fenotípica em comparação à bactéria selvagem. As proteínas LIC13086 e LIC10774 expostas na superfície externa da bactéria exercem diferentes funções durante o processo infeccioso, participando da adesão a tecidos do hospedeiro, evasão do sistema imune e no processo de disseminação durante a leptospirose, além de interferirem diretamente na cascata de coagulação impedindo a formação do coágulo de fibrina. Os resultados obtidos contribuem para o entendimento processo infeccioso das leptospiras.