Investigação da dinâmica de replicação do DNA em Trypanosoma cruzi : sua intersecção com a organização da cromatina e com a transcrição através de técnicas de sequenciamento de nova geração.

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Vitarelli, Marcela de Oliveira
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Trypanosoma cruzi; DNA replication; ORC; Origens de replicação; Replicacão do DNA; Replication origins

A replicação do DNA garante a duplicação do material genético, uma importante etapa do crescimento celular. Este _e um evento complexo, especialmente em Trypanosoma cruzi, que alterna entre formas de vida replicativas e infectivas para garantir o sucesso da infecção e a evolução da espécie. Com o intuito de estudar a dinâmica da replicação de T. cruzi, neste trabalho foram caracterizados os sítios de ligação de Orc1/Cdc6 e Orc1b ao DNA por meio da técnica de ChIP-seq, mostrando que estas proteínas estão distribuídas ao longo de todo o genoma, mas estão enriquecidas em regiões entre os policístrons (coincidindo com sítios de início e término da transcrição) e em genes de famílias multigênicas. Esses dados sugerem que o processo de replicação em T. cruzi possa contribuir para a variabilidade genética das famílias multigênicas. Os sítios de ligação ao DNA de Orc1/Cdc6 e Orc1b foram comparados com origens de replicação previamente identificadas pelo ensaio de MFA-seq, definindo regiões de origens ativas (co-localizacão dos picos de Orc1/Cdc6 e origens do MFA-seq) e origens inativas (picos de Orc1/Cdc6 remanescentes). Ainda, os dados obtidos mostram a co-localizacão de Orc1b com Orc1/Cdc6 e a possível participação de Orc1b no complexo de pr_e-replicacão. A partir da forte presença das origens ativas em genes de DGF-1 e do enriquecimento de nucleossomos dinâmicos nessas regiões, as origens ativas e inativas foram então correlacionadas com a localização dos nucleossomos, obtida previamente por ensaios de MNase-seq, mostrando que a estrutura da cromatina desempenha um papel na ativação das origens de replicação de T. cruzi. Além disso, foram sequenciadas moléculas de DNA nascente incorporadas com BrdU, o que permitiu a detecção do sentido da forquilha de replicação e a determinação de novas origens de replicação, a nível celular. A partir da comparação entre as origens constitutivas determinadas pelo ensaio de MFA-seq, foi possível determinar a localização de origens facultativas e verificar seu enriquecimento em outros genes de famílias multigênicas. Já a partir da comparação entre células em fase exponencial e sincronizadas no início da fase S do ciclo celular, foi possível classificar as origens da cultura não sincronizada como origens ativadas em early ou em late-S e validar a presença de origens de replicação disparadas ao longo de toda a fase S do ciclo celular nas duas unidades de compartimentalização do genoma de T. cruzi, assegurando, assim, que a totalidade do seu DNA seja replicada.