O envolvimento da proteína adaptadora 1 (AP-1) no mecanismo de regulação negativa do receptor CD4 por Nef de HIV-1

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Tavares, Lucas Alves
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: ?2 depletion; acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activit; although not need charging ubiquitination; and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle; and only the AP-1 variant comprising ?2; another subunit of AP-1; AP-1; AP-1 subunits. By pull-down technique; AP-2; AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However; AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However; being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore; but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions; but not ?1; but not ?1 depletion; but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein; by flow cytometry assay; compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the red; compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover; depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT; ESCRT; HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in hu; HIV-1; inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of th; internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes; is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. F; MVB; Nef; not ?1-adaptin; one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response; our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin; regulação negativa de CD4; resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and; resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A; such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome; the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions; the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway; The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distr; the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore; there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This stud; this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two is; this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.; upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes; via overexpression of HRS; we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition; where co-localize with ?2. Together; which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition; y1-adaptina; y2-adaptina
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-06012017-113215/

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal.