Desenvolvimento racional e caracterização funcional de novos transportadores de açúcar de Trichoderma reesei com insensibilidade para glicose

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Taveira, Iasmin Cartaxo
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: 2G Ethanol; Saccharomyces cerevisiae; Engenharia de proteínas; Etanol 2G; MFS; Protein engineering; Xilose; Xylose
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-14012026-173803/

A engenharia metabólica de Saccharomyces cerevisiae para utilização de pentoses (ex.: xilose e arabinose), tem sido explorada para melhorar o desempenho fermentativo na produção de etanol de segunda geração (2G). No entanto, devido à inespecificidade intrínseca dos transportadores de açúcar, ocorre uma competição entre os açúcares (por exemplo, xilose e glicose), levando à redução da eficiência do transporte de pentose e menor produtividade do etanol. Este estudo teve como objetivo desenvolver e caracterizar transportadores de açúcar que tivessem menor afinidade por glicose e mantivessem a capacidade de transportar xilose por meio do melhoramento genético de transportadores de Trichoderma reesei para expressão heteróloga em S. cerevisiae. Para isso foram preditos motivos e sítios de fosforilação a fim de triar o fenótipo de interesse. Os transportadores selvagem e mutantes foram modelados usando o servidor online Robetta e foi feito docking molecular no Autodock Vina. Com base nesses resultados, os transportadores de interesse foram transformados numa cepa de S. cerevisiae para caracterização. Para confirmar o perfil predito, foi feito o drop assay e fermentação aeróbica. A análise in silico mostra que 2 mutações no Str3 (Tr62380) exibiram um fenótipo promissor. Para Tr82309, que ainda não está caracterizado, foi decidido seguir com a caracterização do transportador selvagem. As ORFS foram sequenciadas e confirmadas. O drop assay mostrou que houve reprodutibilidade entre as predições de docking e a análise in vivo. Os mutantes de Str3 (Tr62380) de fato perderam a afinidade por hexoses e mantiveram por xilose, como predito. Além disso, Tr82309 naturalmente tem alta seletividade por xilose. No ensaio de fermentação aeróbica, apenas Str3 (Tr62380)_WT teve alta eficiência em captar os açúcares do meio; as mutações inseridas em Str3 (Tr62380) reduziram a capacidade de transportar glicose, o que foi interessante para os objetivos do trabalho. Dentre as mutações interessantes, a mimética de fosforilação mostrou pela primeira vez in vivo que essa modificação pós traducional pode modular a afinidade de transportadores de açúcar por diferentes substratos. Dessa forma, sugerimos sítios de fosforilação como alvo de engenharia de transportadores de xilose. O docking foi uma ótima ferramenta para triagem de alvos de engenharia dos transportadores estudados, sendo a validação experimental indispensável para confirmar a viabilidade e eficiência fermentativa dos transportadores.