Caracterização da RanBP1 de Nicotiana tabacum e sua interação com NtCDKG;2 na putativa regulação do fuso mitótico

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Thomé, Vanessa
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: BY-2 cells; Células BY-2; Expressão gênica; Fosforilação; Gene expression; Phosphorylation; Ran; SCI1
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-02082024-094153/

Em Nicotiana tabacum, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1) é expresso no meristema floral, estigma/estilete, e regula o tamanho final do pistilo através do controle da proliferação celular. Em busca de proteínas parceiras de interação com SCI1, identificou-se, entre outras proteínas, uma CDK (Cyclin-Dependent Kinase) homóloga à CDKG;2 da planta modelo Arabidopsis thaliana, que foi, então, denominada de NtCDKG;2. Para elucidar a localização de NtCDKG;2 durante o ciclo celular, foram analisadas células BY-2 expressando estavelmente GFP-NtCDKG;2, que foi encontrada junto ao fuso mitótico em metáfase e anáfase. Além disso, foi realizado um screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete no sistema de duplo-híbrido de levedura (Yeast two-hybrid, Y2H) utilizando NtCDKG;2 como isca. Neste screening foram identificadas duas proteínas que atuam no âmbito dos microtúbulos: Ntβ-tubulina e NtRanBP1(Ran binding protein 1). Em conjunto, esses dados sugerem que NtCDKG;2 também pode estar atuando na organização do fuso mitótico em N. tabacum. Em outras espécies, RanBP1 atua na rede de proteínas ligadas à Ran, que durante a divisão celular atuam em diversos aspectos da mitose, como na polarização e estabilização do fuso mitótico e inibição da replicação do DNA. Esse sistema apresenta alta conservação nos eucariotos, entretanto pouco foi estudado sobre a RanBP1 em plantas e, em N. tabacum, nenhum estudo até então tinha sido realizado. Dessa forma, os principais objetivos desse trabalho foram: caracterizar a NtRanBP1, analisar a co-localização entre NtRanBP1 e NtCDKG;2 e testar a interação de NtCDKG;2 com NtRanBP1 e Ntβ-tubulina. Foi mostrado que NtRanBP1 apresenta o domínio de ligação à Ran, aminoácidos com alta probabilidade de serem fosforilados, e putativos sinais de localização e exclusão nuclear. Durante a intérfase, NtRanBP1 é citoplasmática e no início da divisão celular é encontrada no núcleo. No decorrer da divisão celular ela fica concentrada próximo à cromatina, sendo excluída do núcleo no final da divisão, quando o envoltório nuclear se estabelece. A co-localização entre NtRanBP1 e NtCDKG;2 ocorre no início da divisão celular, quando NtRanBP1 é encontrada no núcleo. A interação entre elas foi confirmada por Y2H, bem com a interação entre NtCDKG;2 e Ntβ-tubulina. Foram desenvolvidas plantas de N. benthamiana transgênicas expressando NtCDKG;2-GFP, como ferramenta para aprofundar esses estudos. Nas análises das expressões endógenas em células BY-2, o gene NtRanBP1 é expresso ao longo de todo o ciclo celular, com um pico de indução na transição G1/S, enquanto o gene SCI1 tem uma expressão aparentemente constante durante o ciclo celular. Os resultados encontrados sobre NtRanBP1 são semelhantes ao descrito para seus homólogos de outras espécies, sugerindo que a função de RanBP1 durante o ciclo celular também é conservada em espécies de Nicotiana. Além disso, a interação confirmada entre NtRanBP1 e Ntβ-tubulina com NtCDKG;2, e a co-localização entre NtCDKG;2 e NtRanBP1 durante o início da divisão celular, fortalecem a hipótese de que esta CDK atue na regulação do fuso mitótico.