Bioprospecção de genes biossintéticos de policetídeos em DNA metagenômico de solo de Mata Atlântica.

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Massini, Karen Cristina
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Agentes microbianos; Biodiversidade; Biodiversity; Florestas; Forests; Genes; Genética microbiana; Microbial agents; Microbial genetics; Microbiologia; Microbiology
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-29012010-111747/

A Mata Atlântica brasileira é apontada como um dos mais importantes refúgios da biodiversidade em todo o planeta. Este bioma é extremamente importante sob o aspecto da riqueza de espécies vegetais e animais na sua composição e interações, porém ainda pouco conhecido e explorado sob o ponto de vista microbiológico. Um grama de solo pode conter cerca de 10 bilhões de micro-organismos de diferentes espécies. A maioria dos micro-organismos presentes nos solos não é de fácil cultivo em laboratório (somente 0.1-10% são recuperados), sendo necessária à utilização de novas técnicas para superar este problema. Muitos micro-organismos presentes no solo tem grande importância biotecnológica por produzirem compostos bioativos. O filo Actinobacteria é abundante em solos e de grande importância econômica, tendo em vista que a maioria dos antibióticos comercializados é produzido por membros deste grupo. Porém a biodiversidade microbiana da Mata Atlântica, bem como, o seu potencial biotecnológico não tem sido plenamente estudado. Poucos trabalhos mostram produtos do metabolismo microbiano com potencial em uso em indústrias e mostram menos ainda antimicrobianos produzidos por isolados bacterianos desta região. Dentro deste contexto, o presente trabalho buscou em duas alternativas metodológicas como a técnica independente de cultivo, o metagenoma, verificar a presença de genes de uma importante via biossintética os policetídeos sintases e com a técnica dependente de cultivo, selecionar prováveis bactérias produtoras de composto bioativos. O metagenoma propõe fazer uma análise do DNA total de amostras do solo, visando conhecer a informação gênica destes compostos na complexa diversidade microbiana. Desta forma, várias abordagens foram empregadas para conseguir um DNA de alto peso molecular e de qualidade suficiente para construir bibliotecas metagenômicas, e procurar nestas, genes das vias de sínteses dos policetídeos (PKS) tipo I e tipo II, que ficam agrupados em clusters que variam de tamanho entre 20 a 100 kb. Otimizamos um método de extração de DNA do solo e conseguimos obter um DNA de aproximadamente 50kb, que foi amplificado por PCR utilizando primers para regiões conservadas dos genes policetídeos sintases tipo I e II (acetosintase ) de Actinomicetos. Os fragmentos obtidos, PKS I e PKS II, com tamanho entre 600pb a 700pb, foram clonados, construído-se duas bibliotecas metagenômicas (KSI e KS II). Os clones foram sequênciados e analisados em uma árvore filogenética. A análise filogenética de genes policetídeos tipo I demonstrou similaridade com estes genes de diversas divisões de bactérias, revelando a presença de prováveis genes novos não apenas relacionados a via de PKSI, como também aos genes de PKSI híbridos com peptídeos não ribossomais. Em complemento a filogenia de policetídeos tipo II apresentou uma similaridade com genes de Actinobacteria, formando um grupo que também está relacionados a presença de prováveis genes novos de importantes famílias de antibióticos. Através do cultivo utilizando meio seletivo para o crescimento de bactérias não cultivadas, foi possível isolar sete bactérias que possuem atividade antibacteriana e/ou antifúngica.