Descrição e caracterização de uma nova ?-N-acetil-hexosaminidase (GH3) por metagenômica de solo de manguezal

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: Soares Júnior, Fábio Lino
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Bioprospecção; Bioprospecting; Enzimas; Enzymes; Fosmid; Fosmídeo; Screnning; SDS-PAGE; Triagem
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/64/64133/tde-27012016-141443/

Bactéria e fungos são as principais fontes de enzimas envolvidas na transformação de compostos chave para o fluxo de carbono em solos de manguezal, caracterizado por alta prevalência de anaerobiose, salinidade e elevado teor de matéria orgânica. A decomposição de plantas ou resíduos de animais nestas condições é muito lenta, devido à pressão seletiva sobre a evolução de enzimas envolvidas nos processos de mineralização de nutrientes. A metagenômica, permiti o acesso a grande maioria da diversidade microbiana no ambiente, por meio da geração de bibliotecas de clones, o que resulta em um cenário promissor para bioprospecção de novas atividades enzimáticas. Neste estudo, foi relatada a descrição e caracterização de uma nova ?-N-acetil-hexosaminidase (EC 3.2.1.52) da família GH3, envolvida na degradação da matéria orgânica em solo de manguezal contaminado por derramamento de óleo localizado no município de Bertioga-SP, por meio de uma triagem de 12.960 clones metagenômicos. O clone positivo para a atividade celulolítica foi sequenciado e um total de 1.175.586 reads foram gerados com tamanho médio de 198 pb. As sequencias foram trimadas com base na qualidade de índice PHRED >= 30.0, e remoção de sequencias do hospedeiro (E. coli) e do vetor (fosmídeo), originando um contig final com 39.586 Kb. Entre as ORF\'s anotadas a partir do contig gerado, uma sequencia de 1.065 nucleotídeos foi identificada como codificante para a enzima ?-N-acetil-hexosaminidase, evidenciando baixa similaridade (32 %) com as demais encontradas no bancos de dados comparativos. A enzima foi expressa e purificada, onde uma banda isolada foi visualizada por SDS-PAGE com massa molecular prevista de 43 kDa. Por fim, as atividades ótimas da enzima (30 °C; pH 5.0; 0.5 M de NaCl; diminuição de atividade após 3hs de incubação) foram caracterizadas por meio do indicador p-nitrophenol (pNP) ligados aos substratos GlNac, GalNac e Glc. A detecção da enzima por meio da metagenômica, evidenciou que os manguezais são reservatórios de novas enzimas com características diferenciadas e altos potenciais de aplicabilidades biotecnológicas