Expressão do domínio III da proteína E do vírus Zika em células de Drosophila melanogaster

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Xalega, Alane Leite
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Células S2; EDIII; Immunofluorescence; Imunofluorescência; S2 Cells; Vírus Zika; Zika Virus
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-10052024-083221/

O vírus Zika (ZIKV) é um Flavivírus transmitido por mosquitos que foi identificado pela primeira vez em humanos, em 1952, na Uganda. Desde então foram registados surtos da doença na África, nas Américas, na Ásia e no Pacífico. Em 2016, a Organização Mundial da Saúde (OMS) classificou o ZIKV como a doença viral mais preocupante da atualidade, devido a seu potencial epidêmico e rápida disseminação. O ZIKV causa uma doença febril aguda autolimitante que é associada a complicações neurológicas em adultos e crianças e a microcefalia em bebês. Seu tratamento é feito de forma sintomática já que não há vacinas e nem antivirais específicos para tratamento. O diagnóstico da doença apresenta problemas por este vírus pertencer ao gênero Flavivírus, assim como o vírus da Dengue e da Febre amarela, que também são doenças febris e circulam aqui no Brasil, gerando anticorpos de reação cruzada. O diagnóstico do ZIKV pode ser confirmado pela detecção do genoma viral por amplificação genômica (RT-PCR) e isolamento viral, quando realizados no período de viremia, e podem ser feitos também, testes sorológicos como o ELISA e imunofluorescência, ou PRNT (Teste de Neutralização por Redução de Placas de Lise). Embora existam testes para identificar a infecção por Zika, ainda é necessário um kit diagnóstico específico, condição inclusive imposta pela OMS. Devido as consequências do ZIKV e os prejuízos financeiros que o mesmo gera, o foco deste trabalho é expressar o domínio EIII da proteína de envelope do vírus em células S2 (Drosophila melanogaster Schneider 2), uma vez que este domínio é mais específico entre os flavivírus e não iria gerar reações cruzadas com outros membros da mesma família, ajudando na coleta de dados epidemiológicos e diagnóstico. Para isso, o fragmento correspondente ao domínio III da proteína de envelope (EDIII) do ZIKV foi sintetizado e subclonado, no vetor (pMT/Bip/V5/His-A) de Drosophila melanogaster. A partir desse vetor, isolamos a porção correspondente ao EDIII e subclonamos no plasmídeo pACGPVHygro. Assim, obtivemos o pAc_ZIKVEDIII-Hy, no qual a expressão do EDIII está sob controle do promotor constitutivo da actina de drosófilas. O vetor ainda possui o gene de seleção para higromicina. O pAc_ZIKVEDIII-Hy foi transfectado em células S2 e após seleção com higromicina B, estabeleceu-se algumas linhagens como a S2Ac ZIKVEDIII- Hy Tc5 e a S2Ac ZIKVEDIII- Hy 7 Tc. A expressão da proteína referente ao EDIII do ZIKV foi analisada e verificada por meio de Dot Blotting, Imunofluorescência indireta, Citometria de fluxo, Confocal e Western Blotting. Houve marcação do lisado celular nas técnicas de Dot e Western Blotting, além de ter sido detectada fluorescência por parte das células recombinantes, nas técnicas citadas acima. A partir dos resultados obtidos, houve a confirmação da expressão do domínio EDIII nas células S2.