Goniopsis cruentata: caracterização cinética e bioquímica da (Na+, K+)-ATPase do tecido branquial e análise da sequência de RNAm

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Moraes, Cintya Mendes
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: (Na+,K+)-ATPase; Acclimation; Aclimatação; FXYD2; Goniopsis cruentata; Osmorregulação; Osmorregulation
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-20122019-162421/

Este estudo apresenta as propriedades cinéticas e moleculares da (Na+, K+)-ATPase do tecido branquial do G. cruentata, trazendo informações que contribuem para uma melhor compreensão das adaptações fisiológicas e bioquímicas associadas à ocupação de diferentes ambientes pelos crustáceos. A análise por Western Blotting na presença de anticorpo monoclonal para a subunidade da (Na+, K+)-ATPase confirmou a presença da enzima na fração microsomal. A marcação imuno-histoquímica da (Na+, K+)-ATPase nas brânquias posteriores revela que a enzima está distribuída predominantemente na região apical das células pilares. A centrifugação em gradiente de sacarose indicou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, embora dois picos de proteína tenham sido observados para a atividade insensível a ouabaína. A modulação da atividade (Na+, K+)-ATPase de G. cruentata recém-capturado (21S) pelo ATP ocorreu através de duas famílias de sítios, uma de alta afinidade com VM= 153,4 ± 7,7 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,013 ± 0,0006 mmol L-1 e nH = 1,3, e outra de baixa afinidade com VM= 186,0 ± 9,3 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,085 ± 0,004 mmol L-1 e nH= 3,0. Uma atividade basal de aproximadamente 140 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína foi observada em baixas concentrações de ATP (10-9 mmol L-1). Em condições estequiométricas de Mg2+ e ATP apenas a família de baixa afinidade ATP foi observada, apresentando VM= 443,0 ± 22,1 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,06 ± 0,003 mmol L-1 e nH= 4,0. Os resultados sugerem que excesso de Mg2+ atua como um modulador alostérico e estimula o aparecimento da família de alta afinidade pelo ATP. A atividade (Na+, K+)-ATPase dos animais aclimatados também foi estimulada através de duas famílias de sítios ATP em todas as salinidades estudadas. Os íons magnésio estimularam a atividade da (Na+, K+)-ATPase através de uma única curva de saturação, com VM= 425,9 ± 25,5 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,16 ± 0,01 mmol L-1 e nH= 2,6. De forma similar, a atividade (Na+, K+)-ATPase foi estimulada pelo Na+ (VM= 425,0 ± 23,4 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, , KM= 5,1 ± 0,3 mmol L-1 e nH= 1,5), K+ (VM= 485,3 ± 24,3 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 0,9 ± 0,05 mmol L-1 e nH = 1,5) e NH4+ (VM= 497,4 ± 24,9 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína, KM= 9,7 ± 0,5 mmol L-1 e nH= 1,2). A enzima é inibida pela ouabaína com Ki= 196,6 ± 9,8 µmol L-1. Além da (Na+, K+)-ATPase, foram identificadas na fração microsomal Na+-, K+- e Ca2+-ATPases além de fosfatases neutra e alcalina. Embora a osmolalidade da hemolinfa dos animais aclimatados não variou significativamente, os caranguejos hiperregulam em baixas salinidades e hiporregulam em salinidades mais altas. Uma expressão significativa da subunidade da (Na+, K+)-ATPase foi observada durante a aclimatação a 10 S enquanto para salinidades mais elevadas (20, 30 e 40 S) não ocorreu uma diferença significativa na expressão. Na presença de NH4+ a atividade da (Na+,K+)-ATPase foi estimulada 6% e, de maneira inesperada, inibida 25% na presença de FXYD2. Entretanto, na presença de NH4+ e FXYD2 ocorreu uma estimulação de 10%, sugerindo que o sitio de ligação do peptídeo FXYD2 requer a presença de NH4+ para ser exposto. A adição de AMPc (estimulador da PKA) e PMA (estimulador da PKC) acarretou a fosforilação da subunidade da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo que a fração microsomal também apresenta PKA e PKC endógenas. A eletroforese em condições desnaturantes confirmou a fosforilação da subunidade da (Na+, K+)-ATPase pela PKA. Além disso ficou demonstrado que a fração microsomal apresenta o peptídeo FXYD2, uma vez que foi observada uma banda fosforilada de aproximadamente 7 kD