Aplicação da tecnologia portátil de sequenciamento MinION para análise do metagenoma viral

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Zucherato, Victória Simionatto
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Metagenômica; Metagenomics; Nanopores; Nanoporos; Optimization; Padronização; Pré-processamento; Pre-processing; Vírus; Viruses
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-16102023-115348/

As tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (SNG) mostraram um crescimento acelerado nos últimos anos. Uma das principais aplicações do SNG é a metagenômica, que identifica patógenos emergentes para os quais não há diagnóstico estabelecido. Uma técnica promissora e de custo relativamente baixo é a tecnologia portátil MinION. Um dos maiores problemas da plataforma MinION é a falta de protocolos otimizados (pré-preparo da amostra, concentração viral, extração e amplificação). Portanto, o objetivo desse trabalho é padronizar e otimizar os procedimentos de metagenômica viral aplicados ao sequenciamento de nanoporos. O controle do sequenciamento foi realizado utilizando vírus RNA (bolsa de sangue positiva para HIV, cycle threshold - Ct=25,8) e vírus DNA (citomegalovírus humano cultivado). Estes controles foram utilizados para padronizar os processos de concentração viral, extração e preparo de bibliotecas metagenômicas. Inicialmente, após a degradação enzimática do material do hospedeiro, foi realizada a concentração viral por ultracentrifugação, que foi consequentemente confirmada com microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, foi realizada a concentração viral por método químico utilizando poliacrilamida linear. As amostras concentradas foram extraídas com dois kits diferentes a fim de comparação: QIAamp UltraSens Virus (QIAGEN) e High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume (Roche Life Science). Em seguida, comparamos diferentes métodos de fragmentação do DNA: fragmentação mecânica (Covaris), fragmentação química (endonucleases), amplificação pelo sistema de primer SMART-9N e amplificação isotérmica sem ligação dos fragmentos. Todas as amostras foram sequenciadas utilizando a flow cell 9.4.1 no dispositivo MinION. Na microscopia eletrônica de transmissão visualizamos várias partículas de HIV (tamanho esperado 80-100 nm) bem como uma abundância de fagos, que mostrou a importância da concentração viral. Em seguida, a análise bioinformática revelou que as amostras concentradas por LPA, extraídas pelo kit QIAamp UltraSens Virus e amplificadas pelo método SMART-9N apresentaram maior abundancia viral e número elevado de leituras dos vírus tidos como controles (HIV e CMV). Portanto, propusemos que a metagenômica por sequenciamento de nanoporos seja feita utilizando esses métodos e concluímos que a padronização de todos os procedimentos de pré-processamento de amostras é crucial para melhores resultados de sequenciamento utilizando a tecnologia MinION, que permitirá sua aplicação na área de metagenômica viral e na descoberta de patógenos virais desconhecidos ou reemergentes.