Produção da proteína recombinante humana TGF-β1 (fator do crescimento transformante beta 1) em células de mamífero

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: de Paula, Gabriella Christina Gonçalves Manini
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Fatores de crescimento; Growth factors; Medicina Regenerativa; Proteína recombinante; Recombinant protein; Regenerative Medicine; TGF-β1
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-12122018-112751/

O fator de crescimento transformante beta tipo 1, TGF-β1, é uma proteína extracelular homodimérica secretada por vários tipos celulares, que pode ter ação parácrina ou endócrina. Essa proteína está envolvida em processos celulares de diferenciação, proliferação, mobilidade e formação de matriz extracelular. Além disso, é parte importante dos processos de regeneração tecidual, atuando, de maneira decisiva, no reparo, atraindo macrófagos e fibroblastos para o local da injúria e estimulando a angiogênese. Assim, considerando o papel desse peptídeo no processo regenerativo, o uso de TGF-β1 como proteína terapêutica na área de Bioengenharia Tecidual é bastante promissor. Apesar disso, a venda dessa proteína, para fins terapêuticos, é inexistente no mercado e a proteína recombinante vendida, que só pode ser utilizada em pesquisas científicas, não é produzida nacionalmente e chega a custar R$200.000,00/mg. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é desenvolver uma metodologia de produção do fator recombinante TGF-β1 em células de ovário de hamster chinês (CHO), visando à obtenção de níveis altos de rendimento, e, futuramente, a transferência da tecnologia de produção para a iniciativa privada, tornando possível seu uso na Medicina Regenerativa, sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento. O cDNA de TGF-β1 foi amplificado a partir de um banco de cDNA humano e clonado no vetor proprietário pNU1 de expressão de mamífero. A construção pNU1/TGF-β1 foi utilizada para transfectar estavelmente células CHO DG44 e uma estratégia de co-amplificação foi utilizada para selecionar células transfectantes com maior número de cópias da sequência correspondente a TGF-β1. Estas culturas foram submetidas ao processo de amplificação gênica com concentrações crescentes de metotrexato. Ensaios de Western Blot e ELISA foram realizados utilizando-se o meio condicionado pelas populações selecionadas e por clones superprodutores. Entre os 41clones obtidos, cinco apresentaram maiores níveis de produção de TGF-β1, entre 1.000 e 2.000 ng/mL. Estes clones foram selecionados para a realização de testes de atividade in vitro utilizando-se células A549, que permitem avaliar a transição epitélio-mesênquima. Um ensaio de cicatrização de feridas em peles do dorso de camundongos foi padronizado e utilizado para avaliar a atividade in vivo do clone que apresentou melhor resultado in vitro. A proteína TGF-β1 foi parcialmente purificada por HPLC em uma coluna de afinidade. Portanto, a proteína TGF-β1 humana recombinante foi produzida, apresentando atividade biológica in vitro e in vivo, sendo capaz de reparar eficientemente feridas cutâneas. Essa iniciativa pode oferecer aos pacientes uma alternativa para o tratamento de lesões teciduais, acelerando a cicatrização de feridas e o reparo de tecidos.