Enzimas co-imobilizadas na triagem de ligantes duplo-alvo: estudo de condições

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Reis, Vítor Eduardo Narciso dos
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: β-secretase; Acetilcolinesterase; Alzheimer's disease; Co-immobilization; Co-imobilização enzimática; Doença de Alzheimer; Dual-target; Ensaio de pesca de ligantes; Ligand-fishing; Triagem dual-alvo
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-10032022-150634/

As enzimas β-secretase1 (BACE1) e acetilcolinesterase (AChE), são enzimas diretamente relacionadas ao desenvolvimento de doenças neurológicas como a Doença de Alzheimer (DA) e são alvos biológicos relevantes no desenvolvimento de novos fármacos para tais enfermidades. Nesse contexto, os inibidores enzimáticos representam uma importante estratégia de tratamento e a identificação de compostos que apresentem seletiva capacidade inibitória e baixo efeito colateral é um paradigma do desenvolvimento de novos fármacos para DA. Os tratamentos disponíveis para DA limitam-se ao uso de inibidores da AChE eficientes em fases iniciais da doença. A complexidade e multifatorialidade da DA tem levado ao entendimento sobre a necessidade de identificação de inibidores que atuem em multialvos biológicos, o que demanda o desenvolvimento de ensaios que possam contribuir no entendimento do mecanismo inibitório na presença desses múltiplos alvos. A identificação de compostos com atividade biológica seja de origem sintética ou a partir de misturas complexas como os extratos naturais é uma etapa crucial no desenvolvimento de fármacos e altamente dependente de triagem desses compostos através de ensaios robustos, eficientes e confiáveis. Nesse contexto, esse trabalho apresenta o estudo das condições no desenvolvimento de um método on-line de triagem de ligantes monitorando a modulação da atividade catalítica utilizando as enzimas BACE-1 e AChE covalentemente coimobilizadas em suportes sólidos (suporte-AChE-BACE-1). Após a coimobilização a determinação de constantes cinéticas (Kmapp) e potência inibitória (IC50), de ambas enzimas demostrou a eficiência da imobilização ao não ser observado comprometimento na conformação ativa das enzimas nem prejuízo às suas atividades catalíticas. O método qualificado foi aplicado na triagem de 60 amostras de origem sintética e os resultados comparados à triagem utilizando as mesmas enzimas imobilizadas individualmente. Foram observadas diferenças nas porcentagens de inibição obtidas durante a triagem. Por exemplo, o composto PQM-185 inibiu em maior porcentagem a BACE1 imobilizada individualmente do que a BACE1 coimobilizada com a AChE. São necessárias a determinação de mais constantes cinéticas como constante de inibição e de dissociação para descobrir a origem destas diferenças. Uma estratégia para triagem de ligantes em amostras complexas como extratos naturais envolve o uso da afinidade desses ligantes pela biomolécula, diminuindo o número de candidatos e o tempo despendido nessa etapa. Nesse contexto, foi desenvolvido um método de pesca de ligantes off-line com as enzimas BACE-1 e AChE covalentemente coimobilizadas em partículas magnéticas (MB). Nesse método, após a incubação da amostra com as enzimas MB-AChE-BACE-1, são realizadas etapas de limpeza onde os compostos com afinidade baixa permanecem no sobrenadante e etapas de extração subsequentes nas quais os compostos com maior retenção são removidos utilizando-se uma porcentagem de solvente orgânico. O método foi qualificado com inibidores avaliados no ensaio de atividade realizado no capilar AChE-BACE1, e aplicado em extratos de origem natural onde foi possível observar ligantes presentes na etapa de extração. As enzimas imobilizadas em partículas apresentaram alta atividade e estabilidade durante o armazenamento por 2 meses.