Relação entre estrutura quaternária e cinética enzimática em \'beta\'-glicosidases GH1

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Chagas, Rafael Siqueira
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Beta-glicosidases; Beta-glucosidases; Cinética enzimática; Enzyme kinetics; Glicosídeo-Hidrolases 1 (GH1); Glycoside Hidrolases 1 (GH1); Oligomerização; Oligomerization
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-17012022-161641/

Introdução e Objetivos: As enzimas β-glicosidases agrupadas na família 1 das GlicosídeoHidrolase (GH1) apresentam um dobramento característico (β/α)8, sendo que estes monômeros podem ser organizar em uma variedade de estruturas quaternárias. Existem relatos na literatura de que a estrutura quaternária afeta a atividade de β-glicosidases GH1, mas estes efeitos divergem. Deste modo, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar e mensurar o efeito de duas forças iônicas diferentes sobre a oligomerização e parâmetros de cinética enzimática em β-glicosidases pertencentes à família GH1. Para isto, foram utilizadas como enzimas modelo a β-glicosidase de Spodoptera frugiperda (Sf&#946gly, 5CG0, O61594) e a β-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB, 2O9P, P22505). Materiais e Métodos: As β-glicosidases foram produzidas como proteínas recombinantes em E. Coli BL21 (DE3) e purificadas por cromatografia de afinidade com resina de Ni-Agarose e cromatografia de troca iônica com coluna Source 15Q. Após a purificação, as amostras foram divididas em duas e cada uma delas teve seu tampão respectivamente trocado para citrato-fosfato 100 mM pH 6,0 (CF100) e fosfato 5 mM pH 6 (F5). Estas amostras foram estocadas a 4°C e alíquotas foram retiradas periodicamente para determinação dos parâmetros cinéticos kcat e Km para o substrato p-nitrofenil-&#946-D-glucopiranosídeo. Cromatografias de filtração em gel também foram realizadas para avaliar os estados oligoméricos das enzimas em cada amostra. Adicionalmente, experimentos de SEC-MALS foram realizados para se conhecer o estado oligomérico das enzimas. Resultados: Para bglB, os parâmetros cinéticos kcat e Km das amostras incubadas em CF100 e F5 foram semelhantes e não mudaram ao longo dos dias deincubação. Os perfis cromatográficos, juntamente com os dados de SEC-MALS, mostraram que bglB incubada em F5 está inicialmente na forma monomérica e parece dimerizar-se ao longo dos dias, enquanto bglB em CF100 está na forma dimérica. Neste caso, a incubação em diferentes forças iônicas parece ter levado a diferentes graus de oligomerização, porém, este não se refletiu em diferenças nos parâmetros cinéticos. Já para Sfβgly; os parâmetros cinéticos e os perfis cromatográficos das amostras incubadas em CF100 e F5 não mostraram mudanças significativas ao longo dos dias. Porém, observou-se que em F5 Sfβgly é monomérica, enquanto em CF100 a população da enzima está majoritariamente (70%) na forma dimérica. Além disso, Sfβgly incubada em CF100 mostrou kcat/Km claramente maior que a mesma enzima incubada em F5. Coerentemente, os kcat do dímero e monômero isolados foram estimados em 2,2 s-1 e 0,6 s-1, respectivamente. Conclusão: Como evidenciado pelos resultados obtidos para dois membros das β-glicosidases GH1, parece não haver uma relação única entre a estrutura quaternária e os parâmetros de cinética enzimática nas enzimas desta família.