Construção e caracterização de genomas infecciosos e sistemas subgenômicos de replicons de vírus Zika circulante no Brasil para estudos de replicação e patogênese viral

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Filipak, Nathalia Auwerter
• Orientador(a): Strottmann, Daisy Maria
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/44337
• topic: Zika virus; Proteins; Clone Cells; Virus Zika; Células Clonales; Replicón; Virus Zika; Protéines; Clones cellulaires; Réplicon; Flavivirus; Zika virus; Proteínas; Células Clonais; Replicon

O vírus Zika (ZIKV) recentemente despontou como uma emergência de saúde pública nacional, causando manifestações clínicas graves e expandindo-se rapidamente para outros países das Américas. Estudos filogenéticos sugerem que ao longo do processo evolutivo, o ZIKV adquiriu mudanças genéticas que podem ter contribuído para a emergência do vírus. No entanto, ainda não existem evidências sobre o real papel dessas modificações genéticas na modulação das funções dos componentes virais e aumento da infectividade no hospedeiro humano. Diversas abordagens estão sendo empregadas para suportar estudos de replicação e patogênese viral. Nesse sentido, a tecnologia de clones infecciosos e replicons subgenômicos apresenta-se como uma importante ferramenta para elucidar o papel de fatores virais no ciclo infectivo/replicativo do ZIKV, permitindo a fácil manipulação do genoma e propagação do material genético viral em composição homogênea. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram desenvolver um sistema de replicon subgenômico e clone infeccioso de uma cepa brasileira de ZIKV, utilização da metodologia de amplicons subgenômicos infecciosos (ISA) para geração de ZIKV recombinantes da linhagem africana (cepa MR766NIID) e estudo da mutação pontual glicina(G)/ácido glutâmico(E) no resíduo 121 do domínio protease da proteína NS3 do ZIKV. A fim de alcançar o nosso primeiro objetivo, os fragmentos de DNA sintéticos referentes ao genoma completo da cepa brasileira ZIKV BR 2015/15261 foram clonados em vetor do tipo cromossomo artificial de bactéria (pBAC), contendo o promotor da T7 RNA polimerase. Obtivemos êxito na estratégia de clonagem dos fragmentos de DNA para montagem do replicon subgenômico do ZIKV em vetor pBAC. Todavia, a presença de mutações indesejadas e a funcionalidade do sistema de replicon in vitro precisa ainda ser avaliada. No entanto, a obtenção do clone infeccioso de ZIKV está em fase de finalização Para gerar o clone molecular da cepa MR766NIID do ZIKV, quatro fragmentos de DNA correspondentes ao genoma completo do ZIKV foram utilizados para montagem do genoma viral diretamente em células Vero. A metodologia de ISA possibilitou a geração do vírus parental recombinante (ZIKV MR766wt) e mutante (ZIKV MR766121Mut) sem a presença de mutações expúrias. Os resultados dos ensaios de caracterização biológica in vitro dos ZIKV recombinantes (parental e mutante) demonstraram que a mutação pontual NS3121E reduz a infectividade do ZIKV em linhagens celulares de mamíferos. Por fim, os estudos caracterização de determinantes genéticos do ZIKV, através da utilização de ferramentas de genética reversa, poderá contribuir para melhorar o entendimento dos mecanismos envolvidos na biologia e patogênese do vírus e, eventualmente, possibilitar a identificação de alvos potenciais para o delineamento de estratégias antivirais.