Desenvolvimento e caracterização de linhagem celular expressando estavelmente um replicon repórter do vírus Zika

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Silva, Caroline Simões da
• Orientador(a): Gil, Laura Helena Vega Gonzales
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/33142
• topic: Vírus Zika; Genética reversa; Replicon; Zika virus; Reverse genetics; Reporter replicon; Zika vírus; Genética reversa; Replicon; Replicação Viral; Zika virus/genética; Zika virus/fisiologia; Células Cultivadas; Infecção pelo Zika virus/virologia; Recombinação Genética; Genoma Viral; DNA Complementar

O vírus Zika (Zika virus, ZIKV) é um arbovírus membro da família Flaviviridae e gênero Flavivirus. Seu genoma é de RNA de sentido positivo e constituído por única matriz de leitura, responsável pela tradução das proteínas virais estruturais e não estruturais, ladeada por terminações não codificantes nas extremidades 5ˈ e 3ˈ. Atualmente, a ausência de vacinas ou fármacos anti-ZIKV licenciados e o número de casos reportados de infecções por ZIKV, além das complicações neurológicas decorrentes das infecções pelo vírus, colocam as infecções por ZIKV como um grande problema de saúde pública, sobretudo em regiões tropicais e subtropicais. Diante disso, o presente trabalho objetivou a construção de uma linhagem celular expressando estavelmente um subgenoma autoreplicativo (replicon) do ZIKV, expressando o gene repórter luciferase firefly (FLuc). Para tal, foi utilizado o genoma do ZIKV cepa ZIKVPE243/2015, previamente isolado em Pernambuco e clonado no vetor pSVJS01. A construção foi dividida estrategicamente em 3 fragmentos: i) o primeiro, abrigando a extremidade 5ˈUTR e a sequência do capsídeo do ZIKV; ii) o segundo, formado pelo gene repórter FLuc, uma região de ubiquitinação, gene da neomicina fosfotransferase e o IRES (Internal ribosome entry site) do vírus da encefalomiocardite; iii) o último fragmento, formado pelas proteínas não estruturais do ZIKV. Após a recombinação homóloga, a identidade do replicon, denominado de repZIKVPE243-LucNeoIres, foi confirmada através de PCR e sequenciamento. Transcritos in vitro produzidos a partir do cDNA clonado foram transfectados em células BHK-21 por eletroporação. Três dias após a transfecção, as células foram selecionadas em meio com geneticina (600µg/mL) e a linhagem celular recombinante obtida, BHK-21-rZIKV-LucNeoIres, foi avaliada quanto à expressão de FLuc. Durante 20 passagens, as células BHK-21-rZIKV-LucNeoIres apresentaram um aumento da atividade da FLuc de no mínimo 20 vezes em relação ao controle negativo. Por fim, a linhagem celular recombinante BHK-21-rZIKV-LucNeoIres poderá ser usada para o desenvolvimento de uma plataforma biotecnológica para triagem em larga escala de compostos anti-ZIKV e em estudos sobre a replicação viral.