Desenvolvimento e caracterização de linhagem celular expressando estavelmente um replicon repórter do vírus Zika

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2019
Autor(a) principal: Silva, Caroline Simões da
Orientador(a): Gil, Laura Helena Vega Gonzales
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/33142
Resumo: O vírus Zika (Zika virus, ZIKV) é um arbovírus membro da família Flaviviridae e gênero Flavivirus. Seu genoma é de RNA de sentido positivo e constituído por única matriz de leitura, responsável pela tradução das proteínas virais estruturais e não estruturais, ladeada por terminações não codificantes nas extremidades 5ˈ e 3ˈ. Atualmente, a ausência de vacinas ou fármacos anti-ZIKV licenciados e o número de casos reportados de infecções por ZIKV, além das complicações neurológicas decorrentes das infecções pelo vírus, colocam as infecções por ZIKV como um grande problema de saúde pública, sobretudo em regiões tropicais e subtropicais. Diante disso, o presente trabalho objetivou a construção de uma linhagem celular expressando estavelmente um subgenoma autoreplicativo (replicon) do ZIKV, expressando o gene repórter luciferase firefly (FLuc). Para tal, foi utilizado o genoma do ZIKV cepa ZIKVPE243/2015, previamente isolado em Pernambuco e clonado no vetor pSVJS01. A construção foi dividida estrategicamente em 3 fragmentos: i) o primeiro, abrigando a extremidade 5ˈUTR e a sequência do capsídeo do ZIKV; ii) o segundo, formado pelo gene repórter FLuc, uma região de ubiquitinação, gene da neomicina fosfotransferase e o IRES (Internal ribosome entry site) do vírus da encefalomiocardite; iii) o último fragmento, formado pelas proteínas não estruturais do ZIKV. Após a recombinação homóloga, a identidade do replicon, denominado de repZIKVPE243-LucNeoIres, foi confirmada através de PCR e sequenciamento. Transcritos in vitro produzidos a partir do cDNA clonado foram transfectados em células BHK-21 por eletroporação. Três dias após a transfecção, as células foram selecionadas em meio com geneticina (600µg/mL) e a linhagem celular recombinante obtida, BHK-21-rZIKV-LucNeoIres, foi avaliada quanto à expressão de FLuc. Durante 20 passagens, as células BHK-21-rZIKV-LucNeoIres apresentaram um aumento da atividade da FLuc de no mínimo 20 vezes em relação ao controle negativo. Por fim, a linhagem celular recombinante BHK-21-rZIKV-LucNeoIres poderá ser usada para o desenvolvimento de uma plataforma biotecnológica para triagem em larga escala de compostos anti-ZIKV e em estudos sobre a replicação viral.
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Atualmente, a ausência de vacinas ou fármacos anti-ZIKV licenciados e o número de casos reportados de infecções por ZIKV, além das complicações neurológicas decorrentes das infecções pelo vírus, colocam as infecções por ZIKV como um grande problema de saúde pública, sobretudo em regiões tropicais e subtropicais. Diante disso, o presente trabalho objetivou a construção de uma linhagem celular expressando estavelmente um subgenoma autoreplicativo (replicon) do ZIKV, expressando o gene repórter luciferase firefly (FLuc). Para tal, foi utilizado o genoma do ZIKV cepa ZIKVPE243/2015, previamente isolado em Pernambuco e clonado no vetor pSVJS01. 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Durante 20 passagens, as células BHK-21-rZIKV-LucNeoIres apresentaram um aumento da atividade da FLuc de no mínimo 20 vezes em relação ao controle negativo. Por fim, a linhagem celular recombinante BHK-21-rZIKV-LucNeoIres poderá ser usada para o desenvolvimento de uma plataforma biotecnológica para triagem em larga escala de compostos anti-ZIKV e em estudos sobre a replicação viral.The Zika virus (Zika virus, ZIKV) is an arbovirus member of the family Flaviviridae and genus Flavivirus. Its genome is positive-sense RNA and consists of a single reading matrix, responsible for the translation of structural and non-structural viral proteins, flanked by noncoding endings at ends 5 and 3. Currently, the absence of licensed anti-ZIKV vaccines or drugs and the number of reported cases of ZIKV infections, in addition to the neurological complications resulting from the virus infections, place ZIKV infections as a major public health problem, especially in tropical regions and subtropical regions. Therefore, the present work aimed to construct a cell line stably expressing a ZIKV autoreplicative subgenome (replicon), expressing the reporter gene luciferase firefly (FLuc). For this, the genome of the ZIKV strain ZIKVPE243 / 2015, previously isolated in Pernambuco and cloned in vector pSVJS01, was used. The construct was strategically divided into 3 fragments: i) the first, harboring the 5’UTR end and the ZIKV capsid sequence; ii) the second, formed by the FLuc reporter gene, a ubiquitination region, neomycin phosphotransferase gene and the IRES (Internal ribosome entry site) of encephalomyocarditis virus; iii) the last fragment, formed by the non-structural proteins of ZIKV. After homologous recombination, the identity of replicon repZIKVPE243-LucNeoIres was confirmed by PCR and sequencing. In vitro transcripts produced from the cloned cDNA were transfected into BHK-21 cells by electroporation. Three days after transfection, the cells were selected in medium with geneticin (600μg / ml) and the recombinant cell line obtained, BHK-21-rZIKV-LucNeoIres, was evaluated for FLuc expression. During 20 passages, BHK-21-rZIKV-LucNeoIres cells showed an increase in FLuc activity of at least 20-fold compared to the negative control. Finally, the recombinant BHK-21-rZIKV-LucNeoIres cell line could be used in the development of a biotechnological platfFundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.porVírus ZikaGenética reversaRepliconZika virusReverse geneticsReporter repliconZika vírusGenética reversaRepliconReplicação ViralZika virus/genéticaZika virus/fisiologiaCélulas CultivadasInfecção pelo Zika virus/virologiaRecombinação GenéticaGenoma ViralDNA ComplementarDesenvolvimento e caracterização de linhagem celular expressando estavelmente um replicon repórter do vírus ZikaDevelopment and characterization of cell line stably expressing a Zika virus reporter repliconinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2019-02-21Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães.Mestrado AcadêmicoRecife/PEPrograma de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia em Saúdeinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-83094https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/33142/1/license.txtee3692f7b0b97d5638099ab94397d05fMD51ORIGINAL2019silva-cs.pdf2019silva-cs.pdfapplication/pdf1329434https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/33142/2/2019silva-cs.pdf766b586da87691b0c24f6f7f81f9511eMD52TEXT2019silva-cs.pdf.txt2019silva-cs.pdf.txtExtracted texttext/plain119223https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/33142/3/2019silva-cs.pdf.txtfe0b772686b3c36bd4947aae74663644MD53icict/331422019-05-21 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