Expressão da proteína de envelope e do vírus da febre amarela em Leishmania tarentolae

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Chagas, Michel Gomes
• Orientador(a): Medeiros, Marco Alberto
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://arca.fiocruz.br/handle/icict/61650
• topic: Proteína recombinante; Vírus da febre amarela; Leishmania tarentolae; Sistemas de expressão; Proteína

Os tripanossomatídeos apresentam-se como potencial alternativa para expressão de proteínas heterólogas. O sistema de expressão baseado em L. tarentolae possui uma série de vantagens dentre os sistemas comumente utilizados, incluindo a capacidade de realizar modificações pós traducionais promovendo um padrão de glicosilação mais próximo ao realizado em proteínas sintetizadas por células de mamíferos. Além disso, esse protozoário é facilmente cultivável em meios de baixo custo obtendo-se altas densidades celulares em um curto espaço de tempo, e a possibilidade de secreção da proteína recombinante para o meio de cultura. O objetivo do trabalho é avaliar o potencial desta plataforma de expressão de proteínas recombinantes em L. tarentolae utilizando a proteína E do vírus vacinal da febre amarela 17DD como modelo experimental, para então estabelecer essa ferramenta de expressão no Laboratório de Tecnologia Recombinante. A partir do RNA viral da cepa vacinal, o gene de interesse foi amplificado por RT-PCR, clonado e propagado em E.coli TOP10 no vetor bifuncional pLEXSY-hyg2. Após a transfecção as células de L. tarentolae recombinantes foram obtidas através da seleção clonal em meio sólido seletivo com o antibiótico higromicina e confirmados por PCR e sequenciamento nucleotídico. As sequências nucleotídicas traduzidas em aminoácidos dos clones selecionados demonstraram uma identidade de 100% com a sequência molde do vírus vacinal. Obteve-se um anti soro policlonal a partir da proteína E recombinante produzida em E.coli BL21 DE3 Star. O soro foi caracterizado e demonstrou título de até 512.000, e embora gerado a partir de uma proteína recombiante foi capaz de reconhecer a proteína em sua forma nativa em um extrato de cultura de células infectadas com o vírus vacinal. A expressão da proteína E foi avaliada em amostras de sobrenadantes de cultura, em RPMI e PBS Glucose, e pellets celulares lisados de L. tarentolae por SDS-PAGE e Western Blotting. Contudo, os dados da expressão foram negativos. Ao se avaliar por RTPCR o processamento pós-transcricional das moléculas de RNAm observou-se que os transcritos não possuiam a inserção da sequência spliced leader (SL) necessária para a tradução. Esses dados corroboram com os resultados negativos obtidos por SDS-PAGE e Western Blotting. Investigações futuras devem ser realizadas como o sequenciamento das regiões UTRs para verificação da presença das sequências necessárias para o fornecimento do sinal para a reação de trans-splicing.