Avaliação genotípica e fenotípica de cepas de Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) capazes de induzir a produção de mucinas em células intestinais in vivo e in vitro

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Trovão, Liana de Oliveira [UNIFESP]
• Orientador(a): Gomes, Tânia Aparecida Tardelli [UNIFESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/0013000024jnv
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: Muco; aEPEC; Análise genômica; Fatores de virulência; Citocina pró-inflamatória
• Palavras-chave em Inglês: Mucus; Genomic analysis; Virulence factors; Pro-inflammatory cytokine
• Link de acesso: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/69143

Introdução: Cepas de Escherichia coli estão amplamente distribuídas no intestino humano participando de sua microbiota normal. Porém, há cepas de E. coli patogênicas capazes de causar doenças intra e/ou extra intestinais. Cepas de E. coli enteropatogênica (EPEC) promovem lesões histopatológicas intestinais características (lesão attaching effacing) e são classificadas como típica (tEPEC) ou atípica (aEPEC), onde apenas as tEPEC apresentam o plasmídeo de virulência pEAF (EPEC adherence factor plasmid). Nosso grupo demonstrou previamente que duas cepas de aEPEC (0421-1 e 3991-1) induzem aumento na produção de muco, em modelo de alça ileal ligada de coelho in vivo, fenômeno não observado em uma cepa protótipo de tEPEC. O estudo dessas e de outras cepas de aEPEC é pioneiro e de suma importância para melhor entender o fenômeno de indução de produção de muco intestinal. Objetivo: investigar cepas de aEPEC quanto a características genotípicas e fenotípicas bem como sua capacidade de alterar a produção de mucinas e citocinas em modelos de infecção em células intestinais in vitro e in vivo. Métodos: sequenciamento e análises genômicas diversas foram realizados para investigar a relação filogenética e clonal das cepas 0421-1 e 3991-1 e de outras 11 cepas de aEPEC, seus sorotipos, Sequence Types (ST) e fatores de virulência (FV). Também foi verificada a reprodução do fenômeno de produção de muco em coelhos in vivo e em células caliciformes (LS174T) in vitro, empregando colorações de Ácido Periódico de Schiff (PAS) e Alcian Blue, e imunofluorescência com soros anti-MUC2 e MUC5AC. Para investigar uma eventual relação entre produção de muco e resposta inflamatória, avaliamos a interação e a indução da produção de citocinas no sobrenadante de LS174T e de dois tipos de enterócitos (linhagens Caco-2 e HT29), após a infecção com aEPEC. Resultados: as duas cepas produtoras de muco e duas das demais cepas (1582-4 e 2351-13) compartilharam os mesmos filogrupo (A), ST378, sorotipo O101/O162:H33 e subtipo de intimina (ι2), estavam filogeneticamente relacionadas e produziram muco no modelo in vivo. A análise demonstrou ainda uma ampla diversidade de FVs, confirmando a heterogeneidade genômica do grupo, não tendo sido possível identificar genes ou conjunto de genes de virulência especificamente relacionados com a indução de muco. A infecção de células LS174T, e posterior coloração com PAS, Alcian Blue e marcação por imunofluorescência, revelou uma boa correlação com o ensaio in vivo na identificação de cepas indutoras de produção de muco, e a produção de mucinas secretadas MUC2 e MUC5AC. Verificou-se ainda que todas as cepas aderiram às linhagens estudadas, as quais, porém, não sofreram alteração na produção das citocinas pró-inflamatórias/regulatórias IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70 e TNF-α durante a infecção; com relação a IL-8, foram verificadas alterações que variaram na dependência do tempo de interação e do tipo celular analisado. Conclusões: a investigação conduzida permitiu-nos identificar duas cepas estreitamente relacionadas com as cepas de aEPEC indutoras de produção de muco in vivo, as quais também induziram o fenômeno. A indução de muco in vivo não está associada a um único fator genético, não tendo sido encontrado um fator ou conjunto de fatores de virulência/genes exclusivos ou ausentes, nas cepas indutoras do fenômeno. Também não foi encontrada relação direta entre a indução de muco e aumento de citocinas pró-inflamatórias durante infecção com cepas de aEPEC in vitro. As bases moleculares da interação e resposta celular e a relação entre os fatores de virulência e indução de produção/expressão de muco por células infectadas por aEPEC ainda precisam ser melhor investigadas.